DON生物合成的亚细胞定位和精准外排研究进展

刘馨，方欣，汪爽，王立雯，武德亮，LEE Yin Won，MOHAMED Sherif Ramzy，徐剑宏*，史建荣*

1.江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所，南京210014；

2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江212013；

3.埃及国家研究中心食品毒理与污染物研究所，埃及 吉萨12411

禾谷镰刀菌复合种（Fusarium graminearumspecies complex，FGSC）侵染小麦、玉米等多种谷物，引起粮食减产，造成巨大经济损失。除了减产外，FGSC可以产生多种镰刀菌毒素，严重威胁粮食食用和饲用安全。我国小麦及其制品中污染较为严重的镰刀菌毒素种类包括单端孢霉烯B族毒素脱氧雪腐镰刀烯醇（DON）及其乙酰化衍生物（3-acetyldeoxynivalenol,3-ADON和15-acetyldeoxynivalenol,15-ADON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEN）。DON会抑制蛋白质合成，可引起急性中毒症状，包括呕吐、头晕和动物消瘦、厌食等症状，DON还具有免疫毒性、细胞毒性、致畸性和致癌性[1-2]。为有效控制DON污染对粮食安全和人畜健康的危害，目前全球37个国家或地区针对食品或谷物中DON含量设立了限量标准，我国国家标准GB 2761-2017中规定谷物及其制品中DON限量标准为1 000 μg·kg-1。

为了更好地适应环境，产毒真菌通过产生并分泌包括毒素在内的多种次生代谢产物，进而影响植物细胞或其他微生物的重要蛋白生理功能，造成植物或细胞毒害，成功侵染寄主植物。DON在镰刀菌侵染小麦等寄主的过程中发挥重要作用，是一类关键致病因子[3-4]。DON对拟南芥具有植物毒性（phytotoxicity），会引发植物细胞死亡，抑制抗氧化酶活性相关基因表达[5]。相对应地，包括DON在内的这些有毒次生代谢产物也会对产毒真菌本身具有一定的毒性。因此，产毒真菌需将这些次生代谢物质精准运输至作用部位，通过将有毒次生代谢物质的合成局限在某个亚细胞器中,或通过细胞运输系统及时将其泵出细胞外来隔离潜在的毒害，实现自我保护[6]。

本文将综述现阶段产毒镰刀菌如何避免DON对菌体细胞造成的毒性伤害机制，包括其合成的亚细胞定位、解毒基因和运输机制的研究进展，有助于有针对性地破解其解毒机制，设计研发高效靶向控毒技术，对于镰刀菌毒素的持续防控和粮食安全、人民生命健康保障具有重要意义。

1 禾谷镰刀菌（F.graminearum）中DON生物合成的亚细胞定位

随着禾谷镰刀菌基因组序列的公布和高效遗传转化体系的建立，禾谷镰刀菌（F.graminearum）中DON生物合成途径较为明确。DON化学结构中含有一个来源于法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP）的骨架结构[7]。FPP是一种初级代谢产物中间体，从初始底物乙酰辅酶A到FPP的合成途径称为类异戊二烯（isoprenoid）合成途径。参与FPP到DON合成的TRI基因簇共包含分布在不同染色体上的15个合成酶编码基因、1个转运蛋白和途径特异转录调控因子。这些TRI基因包括位于2号染色体上的25 kb核心合成基因簇（TRI5基因簇）、1号染色体上的TRI1-TRI16基因和3号染色体上的单个TRI101基因[8-12]，其中TRI6和TRI10是途径特异转录调控因子。

最近，禾谷镰刀菌（F.graminearum）中DON生物合成的亚细胞定位研究有了新的发现[13-16]。当处于离体DON合成诱导条件，或在侵染寄主植物的过程中，菌体产毒基因TRI的表达水平显著诱导上调。在产毒诱导培养液（trichothecene biosynthesis induced,TBI）中镰刀菌的菌丝形态发生改变，菌丝顶端肿胀，形成一种类球形和卵圆形的小泡结构。Tri蛋白定位在一个内质网泡重组形成的有序平滑内质网（organized smooth ER，OSER）上，Menke等将这种特殊的细胞小囊泡结构（specific cellular vesicles）命名为DON产毒小体（DON-toxisome），并对其亚细胞定位进行了进一步的研究[14,17-18]。将分别位于DON生物合成途径前端和后端的两个细胞色素P-450加氧酶Tri4p与Tri1p分别融合绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）或红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP），发现融合蛋白的荧光信号与上述3～4 μm大小的囊泡结构共定位。据此推测，DON生物合成的酶促反应及中间产物定位于DON产毒小体内。Isoprenoid合成途径相关酶的编码基因的表达受到TRI基因簇途径特异转录因子TRI6的调控。羟甲基戊二酸CoA还原酶（Hmr1）是Isoprenoid合成途径中的关键酶，模式真菌酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的Hmr1p定位于内质网外周和核周[19]。禾谷镰刀菌（F.graminearum）的Hmr1p::GFP在非DON诱导培养条件（基本培养基minimal medium,MM）中培养时定位于内质网，绿色荧光信号微弱，出现在类似产毒小体大小的囊泡结构外周；当载有Hmr1p::GFP融合蛋白的菌株置于TBI诱导条件培养24～36 h后，绿色荧光信号定位到球形和卵圆形小泡结构（产毒小体），并与Tri4p::RFP的红色荧光共定位[17]。因此，Menke等提出了禾谷镰刀菌（F.graminearum）中DON生物的产毒小体来源于细胞内质网重塑，TRI基因簇定位于该重塑的产毒小体，且证实参与初生代谢Isoprenoid途径相关基因也定位于上述结构[17]。然而，内质网借助何种外力或能量来源以及如何重塑形成产毒小体的分子机制目前尚不清楚。

最近浙江大学马忠华课题组在解析新药剂氰烯菌酯作用机制时发现，禾谷镰刀菌F.graminearum药靶蛋白Ⅰ型分子马达肌球蛋白（FgmyosinⅠ）在DON生物合成和产毒小体形成中起重要作用[20]。FgmyosinⅠ功能缺失后，DON产生量显著降低。真核细胞中Ⅰ型分子马达肌球蛋白MyosinⅠ参与维持细胞膜动态和结构，在多个细胞过程参与细胞膜与肌动蛋白细胞骨架的链接[21]。研究发现，在禾谷镰刀菌(F.graminearum)中，FgmyosinⅠ通过与核糖体相关蛋白（ribosome-associated protein）FgAsc1互 作 调 控DON合成基因TRI1表达。FgmyosinⅠ参与DON产毒小体形成，但并不参与其他几种次生代谢产物的生物合成[15]。进一步将FgmyosinⅠ与RFP报告基因构建融合蛋白明确其细胞定位时发现，在非DON产生诱导条件（MM和PDB,potato dextrose broth）下，Fgmyosin I-RFP融合红色荧光信号弥散分布在菌丝顶端的细胞质中；在产DON诱导条件（TBI）下培养时，红色荧光信号聚集在顶端球形结构中。

为明确FgmyosinⅠ是否定位于产毒小体上，构建了1株表达了FgmyosinⅠ::RFP和Tri1::GFP的融合蛋白菌株，上述菌株在产毒诱导培养下红色荧光与绿色荧光信号共定位；免疫共沉淀（Co-IP）和双荧光互补试验(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)进一步证实了Fgmyosin I和Tri1的细胞共定位。进一步研究还发现，Fgmyosin I与肌动蛋白Actin互作，在肌动蛋白细胞骨架形成过程中起重要作用。利用肌动蛋白聚合抑制剂latrunculin A处理禾谷镰刀菌菌丝时发现，即便在产毒诱导培养条件下，菌体也不能产生典型的产毒小体结构，Tri1::GFP荧光信号在细胞质内呈弥散状，DON的合成量显著降低。随后，Tang等[16]以Ⅰ型肌球蛋白FgmyosinⅠ或Tri1为诱饵，利用亲和性捕获-质谱测定法分析法证实肌动蛋白的盖帽蛋白（Actin capping proteins，CAPs）在产毒诱导条件下能与上述蛋白互作，发现了两个新的产毒小体组分FgCapA和FgCapB。FgCapA和FgCapB形成异质二聚体，并与FgMoyI或Tri1互作；FgCapA和FgCapB缺失后产毒小体形成受阻、DON的生物合成量显著下降，突变体在麦穗上的致病力减弱[16]。

综上所述，禾谷镰刀菌(F.graminearum)的DON生物合成发生在产毒诱导培养或侵染寄主状态下形成的菌丝顶端肿胀囊泡结构，称为产毒小体，定位于OSER，由内质网重组形成。目前已验证包括Tri合成基因、提供DON合成底物的FPP前序Isoprenoid途径中的Hmr1以及Ⅰ型肌球蛋白FgmyosinⅠ及其互作蛋白盖帽蛋白CAP和肌动蛋白Actin等为产毒小体的重要组分，参与产毒小体的形成，FgMyoⅠ-actin细胞骨架系统为产毒小体的形成提供机械能量。

2 Tri12p介导的DON外排解毒机制

通常情况下，真菌次生代谢产物合成基因成簇中包含转运蛋白，尤其是跨膜的被动转运蛋白（major facilitator superfamily transporters，MFS）[22-23]。禾谷镰刀菌(F.graminearum)中DON生物合成TRI基因簇中的TRI12基因编码一个含有14个跨膜功能域的MFS转运蛋白。Tri12p是一类DHA2家族药剂/质子转运蛋白，与多药抗性和氨基酸吸收相关[24]。

拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides）和禾谷镰刀菌中缺失TRI12引起单端孢霉烯（trichothecene）合成量显著下降[25]，TRI12基因缺失突变体在产毒诱导培养条件下生长受到抑制，表明Tri12与菌体自身的解毒相关。将拟枝孢镰刀菌(F.sporotrichioides)的Tri12和编码trichothecene 15-O-acetyltransferase的Tri3进行酵母异源表达后，如在培养条件中添加Tri3底物15-decalonectrin，与单独转化Tri3酵母相比，Tri12和Tri3双转化酵母培养液中能检测到浓度更高的乙酰化产物calonectrin，进一步验证了Tri12作为转运蛋白在DON合成中的跨膜外排功能[26-27]。禾谷镰刀菌中Tri12p定位在液泡质小体和小于1 μm的移动小囊泡上，在细胞中上述小囊泡并非无序排列，而是交替排列在球状的产毒小体周边，Tri12p定位的小囊泡在液泡与产毒小体之间来回移动。随后，酸化的Tri12p定位所在的细胞亚结构如移动小囊泡和液泡内开始合成DON。禾谷镰刀菌受诱导产毒后，培养液会急剧酸化，推测pH的改变可为Tri12p跨膜转运DON提供便利[28]。

综上所述，禾谷镰刀菌中DON的合成与外排可能涉及不同的亚细胞定位，DON的生物合成发生在由内质网重组形成的球状产毒小体（toxisome）中，通过将产毒过程局限在亚细胞器中从而避免菌体受到DON及其合成中间产物的毒害，而Tri12p定位的移动小囊泡在环境酸碱值改变的协助下，将合成的DON分子储存在液泡或质膜内，或通过胞吐作用（exocytosis）将其转运出细胞[23]。

3 Tri101p介导的DON乙酰化解毒机制

除了Tri12p外，乙酰转移酶Tri101p通过催化异单端孢黄醇C3位置的羟基乙酰化，生成乙酰异单端孢黄醇（isotrichodermin），一定程度上降低了DON对菌体的毒性[29]。Kimura等[30]将禾谷镰刀菌的FgTRI101基因在酿酒酵母（S.cerevisiae）中异源表达，重组酵母细胞对单端孢霉烯族类T-2毒素的抗性增强，且FgTRI101基因在T-2毒素处理后诱导表达。此外，异源表达了F.sporotrichioides的TRI101基因的酿酒酵母细胞对另一种单端孢霉烯毒素二乙酰氧辛烯醇（diacetoxyscirpenol，DAS）更耐受[31]。将TRI101基因转至植物中，DAS和DON对转TRI101基因的烟草、水稻和小麦的植物毒性降低，且转基因植株的抗病性也显著提升[26,32-33]。然而，将F.sporotrichioides的TRI101基因敲除后，不会像TRI12基因缺失突变体一样，在产毒诱导培养条件下表现生长缺陷[27]。

4 其他DON解毒/外排机制

除了Tri12p介导的外排和Tri101p介导的乙酰化解毒机制外，Wang等[26]最近报道禾谷镰刀菌(F.graminearum)中还存在其他形式的解毒途径。将TRI12和TRI101基因双缺失后，DON处理未对突变体的菌丝生长产生显著抑制作用，预示着其他解毒形式的存在。随后通过比较DON处理和环己酰亚胺（cycloheximide，一类蛋白质合成抑制剂）处理后的禾谷镰刀菌(F.graminearum)转录组差异发现，包括Tri12在内的15个编码MFS转运蛋白以及参与γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）代谢基因在DON处理组特异上调，推测其可能参与DON的外排，在菌体对DON的自我保护过程中起作用。

5 展望

典型真菌次生代谢合成基因簇（biosynthesis gene clusters,BGCs）通常不仅包括骨架基因在内的合成基因和调控基因来合成目标SMs(secondary metabolites)，往往还配备用于自我保护的外排或解毒机制，免受具有不同生物活性的SMs或其中间产物的毒害。丝状真菌对特定SMs的自我保护机制主要包括将合成局限在某个亚细胞器内和精准外排等。未来，随着更多产毒真菌SMs自我保护机制的解析揭示和对比研究，将为有针对性地破解产毒真菌的解毒机制，设计研发高效靶向控毒技术提供理论依据和分子靶标，对于真菌毒素的持续防控和保障粮食安全和人民生命健康具有重要意义。