某分析仪测定TT4水平异常升高的原因分析

齐永志，于铭钊，刘 敏，乐 宇

解放军总医院第六医学中心检验科，北京 100048

甲状腺疾病是内分泌系统的常见疾病，近年来我国甲状腺疾病发病率明显升高[1-2]。中华医学会内分泌学分会撰写的《中国甲状腺疾病诊治指南》中对甲状腺功能实验室检查指标进行了探讨，认为血清总甲状腺素(TT4)、总三碘甲腺原氨酸(TT3)是反映甲状腺功能状态的最佳指标，其中TT4在甲状腺功能减退的诊断中起关键作用[3]。笔者在临床工作中发现少数标本TT4检测结果升高，与甲状腺功能其他指标结果相矛盾，给临床诊断和治疗带来困难。本研究对TT4结果异常标本在不同的免疫分析仪上进行了比较，初步分析了干扰贝克曼DXI800全自动化学发光免疫分析仪(简称DXI800分析仪)检测TT4的相关因素。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年8月至2019年3月解放军总医院第六医学中心门诊及住院进行甲状腺功能检测的患者150例。选取TT4、TT3、游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)水平均正常的患者50例为TT4正常组。其中男13例，女37例；年龄25～91岁，平均(44.2±11.8)岁。选取DXI800分析仪检测TT4水平升高、TSH水平降低的患者50例为TT4正常升高组。其中男13例，女37例；年龄25～91岁，平均(49.0±13.4)岁。选取DXI800分析仪检测TT4水平升高，TT3、FT3、FT4、TSH水平正常的患者50例为TT4异常升高组。其中男9例，女41例，年龄25～91岁；平均(50.6±18.5)岁。

1.2仪器与试剂 DXI800分析仪及相应配套TT4检测试剂盒、AU5821全自动生化分析仪(简称AU5821分析仪)及相应配套类风湿因子(RF)检测试剂盒均购自美国贝克曼库尔特公司；ARCHITECT I4000全自动化学发光免疫分析仪(简称I4000分析仪)及相应配套TT4试剂盒购自美国雅培公司。所用校准品均为厂家提供的相应配套校准品，免疫多项质控品(批号40340)、特种蛋白多项质控品(批号66380)均购自美国Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1TT4检测 两种化学发光免疫分析仪分别对TT4进行检测，将厂家试剂盒说明书提供的生物参考区间作为结果判断标准，超过参考区间上限为检测结果升高。贝克曼库尔特公司试剂盒说明书提供的TT4生物参考区间为70.0～152.0 nmol/L；雅培公司试剂盒说明书提供的TT4生物参考区间为62.8～151.2 nmol/L。

1.3.2RF检测 在AU5821分析仪上测定3组的RF水平，操作人员熟练掌握检测方法，所有操作严格按照试剂盒说明书进行，检测方法为免疫透射比浊法，超过试剂盒说明书提供的生物参考区间上限(14 IU/mL)为RF检测结果升高，检测线性为10～120 IU/mL。

1.3.3碱性磷酸酶(ALP)检测 选取在DXI800分析仪上TT4水平升高，I4000分析仪上TT4水平正常的16份标本为试验组进行ALP水平测定，同时选取TT4正常组和TT4正常升高组中的标本各16份为对照1组和对照2组，也进行ALP水平测定。检测仪器为AU5821分析仪，检测方法为速率法，以试剂盒说明书提供的生物参考区间(30～120 U/L)为结果判断标准，检测线性为5～1 500 U/L。

1.3.4ALP抗体阻断试验 选取上述试验组中的11份标本进行ALP抗体阻断试验。ALP抗体阻断剂(sALP)购自日本Osaka biochemical plant公司，水平为5 mg/mL。进行平行试验，分成3组：原液组、磷酸盐缓冲液(PBS)组、sALP去干扰组。原液组选取300 μL标本原液，PBS组选取270 μL标本原液再加入30 μL PBS，sALP去干扰组选取270 μL标本原液再加入30 μL sALP。室温孵育30 min，1 000 r/min离心30 s，采用DXI800分析仪对3组标本TT4水平进行检测。

2 结 果

2.1两种仪器对TT4正常组、TT4正常升高组标本检测结果的比较 对两种仪器TT4检测数据进行McNemar检验，两种检测仪器对TT4水平升高的判断比较，差异无统计学意义(P=0.289)，一致性检验Kappa=0.84(P<0.05)，两种检测仪器对TT4水平升高的判断一致性较好。见表1。

表1 两种仪器检测TT4正常组、TT4正常升高组标本的结果比较(n)

2.2两种仪器对TT4正常组、TT4异常升高组标本检测结果的比较 对两种仪器TT4检测数据进行McNemar检验，两种检测仪器对TT4水平升高的判断差异有统计学意义(P=0.001)。见表2。

2.3各组RF检测结果比较 TT4正常组、TT4正常升高组、TT4异常升高组的RF检测结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 两种仪器检测TT4正常组、TT4异常升高组标本的检测结果比较(n)

表3 RF检测结果在各组中比较(n)

2.4各组ALP水平比较 对照1组、对照2组、试验组ALP水平分别为(76.7±23.6)U/L、(77.0±21.5)U/L和(78.1±27.1)U/L，经单因素方差分析，3组ALP水平比较，差异无统计学意义(F=0.014，P=0.986)。

2.5ALP抗体阻断试验后TT4水平比较 sALP去干扰组和PBS组TT4检测结果比较[(166.89±32.17)nmol/Lvs. (193.51±26.03)nmol/L]，差异有统计学意义(t=-2.275，P=0.046)，PBS组和原液组TT4检测结果比较[(193.51±26.03)nmol/Lvs. (185.46±32.70)nmol/L]，差异也有统计学意义(t=2.695，P=0.023)。其中2份标本经sALP去干扰后TT4检测结果落入生物参考区间内。

3 讨 论

临床实验室对TT4水平的检测大多采用抗原抗体反应，但采用的指示系统不同：放射免疫比浊法采用的是放射性同位素标记；临床常用的化学发光法可以用发光物质直接标记，也可采用酶类标记，称为酶联免疫化学发光法；而电化学发光法采用三联吡啶钌进行标记[4]。本研究中DXI800分析仪采用ALP标记TT4，标本中TT4与试剂中的鼠源性TT4抗体竞争性结合，抗原抗体复合物可与包被磁微粒的捕获抗体(羊抗鼠抗体)结合，产生的光量子值与标本内的TT4水平呈反比，以此测定TT4水平。I4000分析仪采用吖啶酯进行标记，吖啶酯标记的TT4与标本中的TT4竞争结合试剂中的羊抗人TT4抗体，检测抗体直接包被的磁微粒，以此测定TT4水平。两种仪器标记物的不同，以及DXI800分析仪捕获抗体的加入，均可能导致两种仪器抗干扰能力及检测结果的差异。

本研究依据DXI800分析仪的检测结果筛选出可能受干扰的标本，进一步试验确定干扰因素，试验目的并不是比较两种检测仪器抗干扰能力的差异，试验结果也不能说明两种仪器整体抗干扰能力的优劣。现阶段TT4免疫定量分析缺乏统一溯源，不同检测仪器检测结果在数值上不具有可比性，在国家卫生健康委员会组织的室间质量评价中，TT4化学发光定量检测也是按仪器进行分组，这是本研究中没有应用配对样本t检验对不同检测仪器数据进行处理的原因。不同检测仪器通过相应的生物参考区间进行判读，结果应该基本一致，TT4正常组和TT4正常升高组的数据分析也表明两种检测仪器一致性较好，Kappa值为0.84。50例DXI800分析仪检测TT4水平升高标本中，有16例在I4000分析仪上检测正常，两种检测仪器对TT4水平升高的判断结果差异较大，说明两种检测仪器的抗干扰能力可能不同。

RF对抗原抗体反应产生干扰的报道较多，对酶联免疫吸附法和化学发光法均可产生干扰，主要原理是RF可以与检测抗体(动物来源)的Fc段结合，干扰抗体与检测物的结合[5-6]。本研究中RF水平检测采用免疫透射比浊法，检测线性为10～120 IU/mL，当检测结果<10 IU/mL时超出了检测线性范围，而RF生物参考区间为0～14 IU/mL，在RF检测结果正常的标本中，大部分结果<10 IU/mL，所以数据按照计数资料进行分析。本研究对TT4正常组、TT4正常升高组、TT4异常升高组进行RF水平检测，差异无统计学意义(P>0.05)，说明RF不是TT4结果异常升高的主要原因。

从检测原理分析，DXI800分析仪标记物是ALP，如果标本ALP水平过高，可能干扰试验，但对I4000分析仪不产生干扰。当DXI800分析仪检测方法为双抗体夹心法时，检测信号值与检测物水平呈正比，标本中的ALP可造成检测信号升高，使检测结果出现假阳性。多项研究表明，内源性ALP可造成肌钙蛋白I、人绒毛膜促性腺激素假阳性[7-9]。当DXI800分析仪TT4检测采用免疫竞争法时，检测信号值与检测物水平呈反比，如果标本中存在高水平的ALP会造成TT4检测结果降低，而不是比真实水平升高，在DXI800分析仪采用免疫竞争法检测睾酮的研究中发现，患者服用合成的ALP治疗后会造成睾酮检测值降低[10]。本研究中对照1组、对照2组、试验组ALP水平检测结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)，说明TT4异常升高组标本中ALP水平没有明显升高，在本研究中ALP不是造成TT4检测结果异常升高的原因。

有研究表明，人体内存在ALP抗体会造成雌二醇检测结果偏高，加入sALP后，检测结果明显降低[11]。该研究也在被测标本中加入不同水平的ALP抗体，证明ALP抗体的存在对DXI800分析仪造成干扰，但不同水平、不同种类的ALP抗体可能会使雌二醇检测结果偏高或偏低[11]。对于免疫竞争法检测TT4，一方面ALP抗体可结合到T4-ALP复合物上，影响酶结合物催化底物发光，另一方面ALP抗体与T4-ALP结合后，可能阻止T4-ALP复合物与抗T4抗体的结合。两种机制均可造成信号值降低，最终使TT4检测结果异常升高。sALP中含有灭活的ALP，可与标本中的ALP抗体结合，消除干扰。本研究中采用sALP去干扰后，TT4水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，同时两份标本经sALP去干扰后结果变为正常，说明ALP抗体的存在对部分标本TT4的检测有干扰，可能影响到临床的诊断和治疗。

此外，若患者体内存在人抗鼠抗体，可以和捕获抗体(羊抗鼠抗体)竞争结合鼠源性检测抗体，可导致抗原抗体复合物不能被捕获抗体捕获，光量子值降低，最终TT4检测值升高。含有鼠免疫球蛋白的阻断剂可以特异性地去除人抗鼠抗体的干扰，但考虑到多余的阻断剂可与捕获抗体结合，难以去除，所以本研究并未进行异嗜性抗体阻断试验，后续研究可进一步对标本中人抗鼠抗体进行直接检测，以证明异嗜性抗体干扰的存在。

综上所述，标本中ALP抗体的存在可能是DXI800分析仪检测TT4水平异常升高的原因之一，采用不同检测仪器复查，同时结合患者临床症状分析，可有效减少不同干扰因素引起的异常结果。