良性前列腺增生患者前列腺组织及外周血Th1/Th2/Th17及相关细胞因子多参数检测的临床意义

张力杰 陈 明 朱伟东

(东南大学附属中大医院泌尿外科，南京 210009)

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)是中老年男性高发疾病之一，早期无明显症状，但随着下尿路梗阻加重，可出现一系列下尿路症状(low urinary tract symptoms，LUTS)，如尿频、尿急、尿失禁等。既往研究认为，BPH患者的LUTS发生原因主要可归结为2类：静态因素(前列腺体积增大)与动态因素(膀胱颈、前列腺平滑肌张力异常)[1]。近期研究发现，前列腺炎症(prostatic inflammation，PI)可能是决定BPH相关性LUTS的另一重要因素，但其与LUTS的确切关系仍存在争议[2]。PI常表现为尿路刺激症状等，其发病机制多与免疫功能下降、炎症感染等相关，因其症状与BPH相似，临床中往往难以区分，影响患者治疗及预后[3]。研究发现，免疫-炎症紊乱与PI密切相关，以活化T淋巴细胞研究最多，且证实辅助性T细胞(helper T cells，Th)参与前列腺疾病的发生发展，但关于Th1/Th2、CD4+T细胞在BPH及PI中的作用尚未完全明确[4]。本研究检测BPH患者前列腺组织及外周血中Th1/Th2/Th17细胞及相关细胞因子表达情况，并区分伴或不伴PI患者的各因子表达水平，探讨多参数联合检测在BPH诊疗中的意义，为BPH的多因子治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象 收集2016年8月～2018年8月在我院接受外科手术治疗的BPH患者120例为BPH组。纳入标准：①符合手术指征并行尿道前列腺电切术治疗，且术后病理检查确诊为BPH；②术前国际前列腺症状评分(IPSS)>13分；③年龄45～85岁；④手术病理及临床资料完整。排除标准：①未经病理检查证实为BPH者；②疑似或明确诊断为前列腺癌者；③存在前列腺手术史者；④存在PI史或反复尿路感染史者。另选择同期且年龄与BPH组相匹配的健康志愿者40例作为对照组，均无急慢性感染、自身免疫性疾病及性传播疾病，近6个月内无严重外伤史及手术史。所有受试者知情同意，研究经我院伦理委员会审核批准。

1.1.2仪器与试剂 FACS Calibur型流式细胞仪(美国BD Bio-science公司)；2010型电化学发光免疫分析仪及配套试剂盒(美国罗氏公司)；PE标记IL-17A单抗、FITC标记CD4及CD25、APC标记CD127、PE标记的IFN-γ、IL-2、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-4、IL-6、IL-10抗体及其通行对照抗体、完全RPMI1640培养基(美国BD公司)；离子霉素、佛波酯(PMA)刺激剂(美国Sigma公司)；其余常规试剂为实验室分析纯。

1.2方法

1.2.1样本采集 受试者隔夜空腹8 h以上，次日清晨取空腹静脉血3 ml置于EDTA抗凝采血管内混匀，室温下1 500 r/min离心5 min，吸取血浆分装于冻存管，-80℃保存备用。

1.2.2CBA法检测外周血Th1/Th2/Th17细胞因子水平 采用15 ml离心管，按照CBA Flex Set试剂盒制备细胞因子标准品(2 500 pg/ml)，按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256梯度标记8个流式管，检测稀释液作用标准阴性对照。上述各管内分别加入稀释液300 μl，并从原液管开始逐步按照相应比例稀释。捕获微球后分别取出10 μl，根据需要检测的总样本数计算总微球吸取体积=样本数×10 μl。本次检测7个因子即捕获7种微球，混合后于200 g离心5 min，弃上清，血清增强液中重悬，振荡混匀，室温下避光保存30 min。各试管中加入捕获微球混合品各50 μl，标准管中加入等量稀释后的标准品，样本管加入待测样本50 μl，各试管中均加入人Th1/Th2/Th17藻红蛋白检测试剂各50 μl。室温下避光孵育3 h，加入1 ml洗液离心5 min，弃上清，加入洗液300 μl进行微球重悬处理。涡旋振荡3～5 s混匀，上机检测，采用FCAP Array v3.0软件绘制标准曲线并进行数据分析。

1.2.3外周血Th1/Th2/Th17细胞数量检测 取抗凝血100 μl于试管中，加入等量无血清RPMI1640培养液(1∶1)，加入5 μl PMA工作液(1 μg/ml)、离子霉素工作液4 μl与6 μl莫能霉素工作液(0.1 mg/ml)混匀，37℃、5%CO2培养4～6 h。取出培养试管，加入20 μl CD4-FITC抗体于室温下避光孵育20 min，加入BD固定破膜剂进行细胞固定破膜，室温下避光孵育20 min，PBS洗涤1次，分别加入IFN-γ-APC、IL-4-PE-CY5与IL-17-APC-H7单抗混匀，室温避光孵育30 min，350 g离心30 min，含1%FBS的PBS洗涤2次，弃上清。加入200 μl含1%FBS的PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。按照上述步骤制备同型对照管，加入IgG1-FITC、IgG-PE抗体进行检测，各管细胞数为20 000个，计算Th1/Th2/Th17细胞百分比，Flowjo 7.6.2 软件分析数据。

1.2.4前列腺组织中IL-17蛋白表达检测 BPH组患者在TURP术中采集病灶组织，采用4%甲醛固定、石蜡包埋并连续切片，切片厚度3 μm，HE染色。由2名经验丰富的病理科医生进行双盲阅片，并根据国际前列腺炎组织学分类标准进行组织炎症分级评价，分为无炎症、轻度炎症(组织内有散在炎症细胞浸润)、中度炎症(聚集性分布炎症细胞，但无腺体上皮组织损伤或淋巴样小结节)、重度炎症(聚集性炎症细胞并形成淋巴样小结节或伴腺体上皮组织损伤)[5]。采用免疫组化法测定组织中IL-17A、IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10蛋白表达。细胞基质和(或)细胞核呈棕色颗粒沉着为阳性。选择染色良好区域测定灰度值，采用Leica Q550CW图像采集分析系统分析，选择3张染色较好的切片置于显微镜下观察(×400)，每张切片随机选择5个视野，测定单位面积内染色细胞(阳性)光密度值(A)作为蛋白表达，以β-actin为内参。

2 结果

2.1HE染色结果 BPH组HE染色镜下可见腺体上皮细胞为簇状增生或乳头状增生，上皮细胞体积较大，无明显核仁，细胞质淡染，胞核呈短梭形，胞间界限模糊不清。91例符合PI标准，占75.83%，其中，轻度炎症24例，中度炎症49例，重度炎症18例。

2.2各组一般资料比较 3组研究对象年龄、体重指数(BMI)差异无统计学意义(P>0.05)；BPH-PI组患者病程、前列腺体积、总前列腺特异性抗原(t-PSA)及IPSS评分显著高于单纯BPH组(P<0.05)，但单纯BPH组的t-PSA与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组一般资料比较Tab.1 Comparison of general data of each group

2.3各组Th1/Th2/Th17细胞比例比较 与对照组相比，BPH组Th1细胞比例、Th1/Th2比值和Th17细胞比例明显升高(P>0.05)且BPH-PI组变化更为显著，Th2细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组Th1/Th2/Th17细胞比例比较Tab.2 Comparison of Th1/Th2/Th17 cell percentage in each group

2.4各组外周血Th1/Th2/Th17相关细胞因子水平比较 与对照组相比，单纯BPH组和BPH-PI组外周血IL-17A、IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10水平显著升高(P<0.05)，且BPH-PI组显著高于单纯BPH组(P<0.05)。见表3。

表3 各组外周血Th1/Th2/Th17相关细胞因子水平比较Tab.3 Comparison of levels of Th1/Th2/Th17 related cytokine in peripheral blood of each

2.5BPH患者前列腺组织中Th1/Th2/Th17相关细胞因子蛋白表达比较 BPH-PI组患者前列腺组织中IL-17A、IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10蛋白表达显著高于单纯BPH组(P<0.05)。见表4。

表4 BPH患者前列腺组织中Th1/Th2/Th17相关细胞因子蛋白表达比较Tab.4 Comparison of Th1/Th2/Th17 related cytokine proteins expressions in prostatic tissues of BPH

3 讨论

免疫学认为，男性生殖系统是免疫优势系统，免疫性炎症在BPH发病中的作用近年备受关注[6]。研究发现，BPH患者的病灶组织中存在组织学炎症，主要为T淋巴细胞浸润，推测自身免疫紊乱导致前列腺在内的生殖系统损伤可能是BPH及PI的发病基础，而感染、创伤等属于促进因素[7]。本研究中，75.83% BPH患者伴有PI，55.83%为中、重度炎症，且伴有PI的BPH患者具有更长的病程、更大的前列腺体积、更高的t-PSA水平和IPSS评分，证实BPH患者普遍具有局部炎症，但文献报道仅5%～10% PI患者具有细菌感染证据，大部分患者的病因及病机尚未明确，同时，局部组织中免疫性炎症是否会引起BPH患者组织、外周血中免疫细胞及相关细胞因子异常表达尚未明确[8]。

Th细胞是T淋巴细胞的主要亚群之一，按其分泌细胞因子的功能差异可分为Th1、Th2与Th17 3个亚群，其中，Th1/Th2平衡主要影响机体细胞因子网络平衡，Th17细胞则具有双向免疫调节作用，可正向调节NK细胞与Th1细胞功能而介导免疫反应，又可介导免疫逃逸、耐受与抑制等[9]。本研究中，BPH患者的Th1细胞比例显著高于对照组，且BPH-PI组明显高于单纯BPH组(P<0.05)，Th2细胞略有升高差异无统计学意义(P>0.05)，但BPH患者的Th1/Th2比值明显升高，且以BPH-PI组升高更为显著。证实BPH患者中存在外周血Th1/Th2细胞失衡，且Th1占据相对优势地位。Th17细胞是一种近期发现的CD4+T淋巴细胞，其作用机制与Th1/Th2具有较大差异，主要通过分泌IL-17等细胞因子参与机体自身免疫或炎症反应[10,11]。本研究中，BPH患者外周血中Th17细胞比例较对照组明显升高，且BPH-PI患者升高更为显著(P<0.05)，提示Th17细胞过表达可能参与BPH的发生发展。

细胞因子是由免疫、炎症细胞分泌的主要调节因子，促炎细胞因子是诱发免疫反应的关键因素，同时也可通过诱导免疫应答抗感染、肿瘤等。在炎症状态下，大量炎症细胞因子及生长因子释放可上调凋亡抑制因子(如bcl-2)表达，导致前列腺细胞大量增殖而发病[12]。因此，多种炎症因子在机体免疫-炎症系统中具有持续性、协调性、多效应性作用，多参数检测具有重要意义。因传统ELISA法一次性仅可完成1种细胞因子检测，故本研究采用CBA技术进行一次性多参数检测。Th1细胞分泌的IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-2均属于炎症调节因子，TNF-α、IFN-γ属于促炎细胞因子，可诱导多种炎症因子释放，导致炎症级联反应，并可诱导炎症细胞黏附、趋化与浸润，还可抑制组织金属蛋白酶(matrix metalloprote inase,MMP)抑制因子合成而引发MMPs过表达，导致局部组织中MMPs沉积而导致强烈炎症反应[13]。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10，其中，IL-4和IL-10可通过对IL-1、TNF-α等的抑制效应而发挥抗炎效应，并可降低前列腺组织中靶分子的稳定性而加速其降解，从而发挥清除炎症的作用[14]。研究显示，PI患者的外周血及精液中IL-10表达较健康对照组明显升高，且其含量越高患者临床症状越严重，原因可能为IL-10在T淋巴细胞与单核细胞中的表达与其他细胞因子表达相对滞后，在炎症状态下为抑制炎症反应反馈性升高，证其对促炎细胞因子具有持续、反馈性抑制作用[15]。IL-6属于多功能细胞因子，在正常生理状态下可调节免疫应答并促进细胞增殖分化，在病理状态下可诱导IL-2等细胞因子生成，可促进造血及细胞的增殖分化，激活免疫反应及NK、T、B细胞等，募集T细胞而扩大炎症反应[16]。本研究中，BPH组患者血清IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10水平较对照组明显升高，且BPH-PI组明显高于单纯BPH组(P<0.05)，与李云祥等[17]报道并不完全一致。而王磊等[18]研究显示，61.11%的BPH患者伴有PI，且存在明显的IL-6及TNF-α高表达，与本研究结论一致。因此认为Th1/Th2细胞及其相关细胞因子失衡所介导的免疫炎症反应可能仍参与BPH发病过程，但具体机制有待深入研究。IL-17是由Th17细胞分泌的促炎细胞因子，IL-17A是其主要亚型，可作为前炎症介质而诱导IL-1、TNF-α、IL-6等的释放而放大炎症反应，已被证实在自身免疫性疾病的发生发展中具有重要作用[19]。本研究中，BPH组患者血清IL-17A水平明显高于对照组，且BPH-PI组显著高于单纯BPH组(P<0.05)。提示由IL-17A所介导的炎症反应可能在BPH的发生发展中发挥重要作用。局部组织检测显示，BPH-PI患者的前列腺组织中IL-17A、IL-2、TNF-α、INF-γ、IL-4、IL-6、IL-10蛋白表达均高于单纯BPH患者(P<0.05)，与蒋玉清等[20]报道结论相符。证实Th1/Th2/Th17相关细胞因子过表达可能参与BPH发生发展，且以IL-17A蛋白表达升高最为显著，推测局部Th17细胞浸润及其释放的IL-17A所导致的炎症反应可能在BPH的发生发展中发挥重要作用，但仍需进一步研究。

综上所述，Th1/Th2/Th17细胞及其相关细胞因子表达失衡在BPH发生发展中具有重要作用，主要表现为Th2向Th1转化和Th17过度活跃，且与多种细胞因子异常表达有关，在BPH-PI其患者中表现更为明显。Th1/Th2/Th17细胞及相关细胞因子表达失衡可能通过局部或全身慢性炎症在BPH发生发展中发挥特异性作用，多参数联合检测细胞因子水平对评价疾病免疫微环境或监测疾病的发生、发展及临床治疗具有重要参考价值。PI是BPH发生发展的结果或诱因，或两者互为诱因，仍需继续探讨，但可以肯定的是伴发PI可加重BPH病情，临床诊疗中应引起高度重视。