儿童慢性乙型肝炎肝组织HBsAg、HBcAg的表达与抗病毒疗效的关系

王丽旻 , 刘树红, 朱世殊, 董 漪, 徐志强, 王福川, 闫建国, 王 璞,李爱芹, 曹丽丽, 赵 攀, 张 敏

解放军总医院第五医学中心 a.肝病学部，b.感染学部, 北京 100093

慢性乙型肝炎是由HBV复制及其引起的免疫应答，导致肝细胞损伤及炎症，而炎症反复存在是疾病进展的重要因素[1]。目前临床上主要以血液学指标(HBsAg、HBeAg、HBV DNA、肝功能等)作为病毒复制和肝损伤的标志，肝组织HBsAg、HBcAg的表达与肝脏病变程度和临床特征的关系，主要是成人的研究[2-5]，而肝组织HBsAg、HBcAg的表达与抗病毒疗效的相关性目前尚无研究。本研究对儿童慢性乙型肝炎患者肝组织HBsAg、HBcAg的表达与其临床特征及抗病毒疗效做初步的相关性分析。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2014年1月—2017年12月在本院青少年肝病科住院的明确诊断为慢性乙型肝炎的6月～16岁儿童患者的病例资料，患者均是初次抗病毒治疗。慢性乙型肝炎的诊断均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[6]的诊断标准；排除标准：合并甲、丙、戊型病毒性肝炎，肝豆状核变性，CMV、EBV合并感染。

1.2 方法 抗病毒治疗前查血常规，肝、肾功能，血糖，乙型肝炎血清学标志物，HBV DNA定量，HBsAg定量，甲状腺功能和自身抗体。在家长知情同意下行肝脏活组织检查。治疗方案：年龄<1岁的儿童予拉米夫定单药，如在1岁内发生HBsAg阴转，一直用拉米夫定，否则1岁后加IFNα，年龄≥1岁的儿童先单用标准IFNα治疗，剂量按 3～5 MU/m2体表面积，隔日1次[7]；24周时如HBV DNA下降≥2 log10或HBsAg清除则继续单用IFNα治疗，否则加用拉米夫定(年龄<2岁，3 mg·kg-1·d-1)[8]或恩替卡韦(年龄≥2岁，体质量15 kg用0.25 mg/d；15～30 kg用0.25/0.5 mg交替，1 次/d；30 kg以上用0.5 mg/d)口服治疗。IFNα的疗程52～104周。记录治疗和随访期间所有的不良事件和合并用药。

1.3 监测项目 所有儿童每3个月随访，监测血常规，肝、肾功能，乙型肝炎血清学标志物，HBV DNA定量，HBsAg定量，甲状腺功能和自身抗体等。乙型肝炎血清学标志物采用罗氏E170电化学发光法检测，HBsAg定量采用罗氏试剂定量检测。HBV DNA检测值下限为≤20 IU/ml(COBAS HBV Amplicor MonitorTM)。肝脏病理检查：应用Scheuer标准，肝脏炎症坏死(G)分级为0～4，肝纤维化(S)分期为0～4。肝穿刺标本镜下包含4个及4个以上可供评价汇管区，由本院病理科医师读片，在光镜下观察判定炎症活动度分级、纤维化分期和肝组织内HBsAg、HBcAg的表达强度。肝组织内HBsAg、HBcAg表达检测采用免疫组化LDP法染色，试剂购自福州迈新生物技术有限公司。染色强度参照Chu等[9]提出的标准：无肝细胞着色为(-)，着色肝细胞小于10%为(+)，10%～50%为(++)，>50%为(+++)。肝组织内HBsAg、HBcAg 表达强度的评价参考半定量计分法:在排除非特异性染色前提下,黄色、棕色和棕褐色颗粒为阳性。

1.4 伦理学审查 本研究方案经由解放军总医院第五医学中心伦理委员会审批，批号：2015151D，所有患者家属均签署知情同意书。

1.5 统计学方法 用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。非正态分布的计量资料用M(P25～P75)表示,组间比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。以肝组织 HBsAg和HBcAg染色阳性和阴性为应变量，以可能影响其表达强度有意义的相关因素为自变量，进行logistic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 共纳入276例患者，年龄0.5～16岁，中位年龄4.91岁，男性167例(60.51%)，女性109例(39.49%)。213例(77.17%)患者母亲HBsAg阳性；5例(1.81%)父亲HBsAg阳性；4例(1.45%)输血史；20例(7.25%)家庭内其他成员HBsAg阳性；34例(12.32%)传染途径不明。HBeAg阴性14例(5.07%)。肝脏病理提示，肝脏炎症(G)0～1级4例(1.45%) ，1级62例(22.46%)，1～2级25例(9.06%)，2级145例(52.54%)，2～3级19例(6.88%)，3级21例(7.61%)；肝纤维化分期(S)0期9例(3.26%)，0～1期15例(5.43%)，1期119例(43.12%)，1～2期39例(14.13%)，2期47例(17.03%)，2～3期13例(4.71%)，3期20例(7.25%),3～4期4例(1.45%)，4期10例(3.62%)。276例儿童中肝组织HBsAg表达阳性249例(90.22%),HBsAg阴性27例(9.78%)；肝组织HBcAg表达阳性163例(59.06%),HBcAg阴性113例(40.94%)。

2.2 肝组织HBsAg及HBcAg免疫组化染色的临床特征比较 依据肝组织的HBsAg阳性及阴性分组、HBcAg阳性及阴性分组，分别比较2组儿童的各临床基线指标的差异(表1)。肝组织HBsAg染色阳性组年龄及血清HBsAg定量高于阴性组(P值均<0.05)。肝组织HBcAg染色阳性组HBeAg阳性率高于阴性组，ALT、AST水平及肝组织纤维化分期S≥3期的比例均低于阴性组(P值均<0.05)。

表1 儿童肝组织HBsAg与HBcAg不同分组各临床基线指标的比较

将上述有统计学意义的变量纳入logistic回归分析，影响肝组织HBsAg染色阳性的因素为血清HBsAg定量(HR=0661，95%CI：0.561～0.711，P=0.015)，影响肝组织HBcAg染色阳性的因素为HBeAg阴性或阳性(HR=1.512,95%CI:0.751～1.963,P=0.041)。163例肝组织HBcAg阳性的儿童中123例(75.46%)为胞浆型，35例(21.47%)为胞浆、胞核混合型，5例(3.07%)为胞核型。

2.3 肝组织HBsAg及HBcAg表达与HBsAg阴转率、HBeAg转换率的关系 276例患者中186例完成IFNα或单用拉米夫定停药，并进行了6个月的随访。186例儿童中155例(83.33%)获得HBeAg血清学转换，76例(40.86%)获得HBsAg阴转。

186例患者治疗前肝组织HBsAg表达为-、+、++、+++分别有21例、125例、34例、6例，经治疗获得HBeAg血清学转换及HBsAg阴转情况见表2。肝组织HBsAg表达强度越高，HBsAg阴转率越低。

186例患者治疗前肝组织HBcAg表达为-、+、++、+++分别有74例、101例、9例、2例，经治疗获得HBeAg血清学转换及HBsAg阴转情况见表2。肝组织HBcAg表达强度越高，HBeAg转换率越低。5例肝组织HBcAg阳性胞核型的儿童3例完成治疗及随访，均未获得HBeAg转换。

表2 186例完成治疗的儿童治疗前肝组织HBsAg、HBcAg表达不同疗效的差异

2.4 肝组织HBsAg及HBcAg表达模式与HBsAg阴转率、HBeAg转换率的关系 将肝组织HBsAg及HBcAg表达模式分为4种：HBsAg及HBcAg均阴性、HBsAg阴性及HBcAg阳性、HBsAg阳性及HBcAg阴性、HBsAg及HBcAg均阳性。比较4种表达模式与HBsAg阴转率及HBeAg转换率的关系：HBeAg转换率和HBsAg阴转率(均100%)以HBsAg及HBcAg均阴性组最高，HBsAg阳性及HBcAg阴性组的HBsAg阴转率最低(32.31%)，HBsAg及HBcAg均阳性组HBeAg转换率(80%)最低(表3)。

表3 肝组织HBsAg、HBcAg 4 种表达方式抗病毒疗效的差异

3 讨论

本组儿童276例肝脏炎症(G)2级以上的患者为 63.41%(185例)，3级为7.61%，无1例为4级，考虑与儿童慢性乙型肝炎致肝衰竭的比例较低有关[10]。肝脏纤维化分期(S)≥3中重度纤维化占12.32%(34例)，较2014年张鸿飞等[11]报道的重度肝纤维化和肝硬化为14.59%低，较朱世殊等[12]报道的1～7岁儿童慢性乙型肝炎肝脏重度纤维化为10.9%高。考虑与近年临床医师对儿童慢性乙型肝炎的病情评估以及抗病毒治疗的重视有关，而朱世殊研究的对象年龄小。但儿童慢性乙型肝炎患者有重度肝纤维化的风险，临床医师应重视病情评估适时抗病毒治疗。

本研究中肝组织HBsAg表达阳性率为90.22%，较吴家箴等[2]报道的成人研究98.1%和应盛等[3]报道的94.67%低。本组肝组织HBsAg阳性组儿童的年龄大于HBsAg阴性组，血清HBsAg定量高于阳性组，logistic回归分析显示，影响肝组织HBsAg染色的因素为血清HBsAg定量。而成人的研究[2-3]提示HBsAg阳性患者的年龄小于HBsAg阴性患者。考虑与儿童患者感染HBV的时间短以及肝组织病毒学表达与成人有差异相关，本结果还需扩大样本量，各年龄分段进一步证实。

本组儿童肝组织HBcAg表达阳性为59.06%，高于成人的结果42.6%和55.63%[2-3]。而且本组肝组织HBcAg阳性的儿童中75.46%为胞浆型，21.47%为胞浆、胞核混合型，仅3.07%为胞核型。HBcAg存在HBV Dane颗粒和受感染的肝细胞中，有极强的免疫原性。成人的研究[13-14]认为，在肝组织中HBcAg的表达由核型、核浆混合型、浆型及核浆阴性的转换(病毒抗原递呈的改变)，而表现为免疫耐受逐渐被打破。本组儿童肝组织HBcAg阳性率高于成人，提示儿童期也可以有明显的免疫活动。而且本组肝组织HBcAg阳性的儿童近97%为浆型和浆核混合型，提示这些儿童已经打破了免疫耐受。肝组织HBcAg免疫组化染色阳性组血清HBeAg阳性率高于阴性组，ALT、AST、肝组织纤维化分期S≥3期的比例低于阴性组。但影响肝组织HBcAg染色的因素为HBeAg阳性比例。成人的研究[2-3]也同样得出肝组织内HBcAg表达阳性ALT、HBeAg阳性的构成，肝组织纤维化分期均小于阴性患者。但本组儿童肝组织HBcAg阳性患者血清HBV DNA水平及肝脏炎症程度分级与阴性组差异不显著，而成人研究提示肝组织HBcAg阳性组HBV DNA水平高于阴性组，肝脏炎症程度分级低于阴性组。考虑与儿童慢性乙型肝炎患者HBV病毒学特点与成人有差异相关。

本组完成IFN或拉米夫定单药停药的儿童中83.33%获得HBeAg血清学转换，其中40.86%获得HBsAg阴转，较Liu等[15]报道的单用长效IFN治疗52周的HBeAg转换率49%高，而较HBsAg清除率53.8%低，但均明显高于成人[1]。考虑与两组儿童的治疗方案不同有关。对本组儿童肝组织HBsAg及HBcAg表达强度分级，比较不同强度与抗病毒疗效的相关性。结果发现肝组织的HBsAg表达强度越高，HBsAg阴转率越低。肝组织的HBcAg表达强度越高，HBeAg血清转换率越低。3例肝组织HBcAg阳性胞核型的儿童均未获得HBeAg转换，提示肝组织HBcAg胞核型阳性可能为免疫耐受期。本组儿童发现肝组织HBsAg、HBcAg均阴性者 HBeAg血清转换率及HBsAg阴转率均最高，而HBsAg阳性及HBcAg阴性儿童的HBsAg阴转率最低，HBsAg及HBcAg均阳性者HBeAg转换率最低。HBsAg是HBV的外膜蛋白,最近的研究[16]认为，针对HBsAg特异性细胞毒性T淋巴细胞数量缺乏和/或功能不足，是导致慢性HBV感染者发生免疫耐受的重要原因，而儿童HBV感染肝组织不表达HBsAg是否可能无这种T淋巴细胞数量缺乏和/或功能不足，所以儿童的抗病毒治疗优于成人还有待于实验室进一步证实。虽然HBcAg是免疫反应的主要靶抗原,但HBcAg的表达强度越高而HBeAg转换率越低，考虑与HBV感染的免疫应答为多因子参与以及肝组织HBcAg表达的组织代表性有限有关。

由此，本组儿童慢性乙型肝炎患者肝组织HBsAg表达阳性率低于成人，肝组织HBcAg阳性率高于成人，肝组织的HBsAg表达强度越高，HBsAg阴转率越低。肝组织的HBcAg表达强度越高，HBeAg血清转换率越低。肝组织HBsAg、HBcAg均阴性者HBeAg转换率及HBsAg阴转率均最高。但由于肝穿刺组织的代表性可能会有偏差，另外抗病毒疗效受患者的年龄、ALT、HBV DNA、HBsAg水平及抗病毒治疗方案等多因素的影响，因本研究完成抗病毒治疗的病例数较少，故只做初步探索性的比较。肝组织HBsAg、HBeAg的生物学特点以及与抗病毒治疗的关系还需进一步扩大样本量继续研究。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：王丽旻负责课题设计，资料分析，撰写论文；刘树红、朱世殊、董漪、徐志强、王福川、闫建国、王璞、李爱芹、曹丽参与收集数据，修改论文；赵攀、张敏负责拟定写作思路，指导撰写文章，并最后定稿。