臭氧抑制溶血磷脂酸引起的神经病理性疼痛和背根神经髓鞘相关糖蛋白及 TNF-α 上调*

陈珊雅 彭良玉 王喜连 周忠群 唐 杰 谢 斌 陈素昌

（南华大学附属第一医院1 疼痛科；2 麻醉科，衡阳 421001）

大量的研究证实溶血磷脂酸 (lysophosphatidic acid, LPA) 在神经病理性疼痛的启动和维持中起着重要的作用，这意味着LPA 是治疗神经病理性疼痛的一个重要的靶点。我们的前期研究也证实，鞘内注射LPA 可以诱导背根神经脱髓鞘产生神经病理性疼痛。医用臭氧 (ozone, O3) 在临床上被用于治疗各种形式的疼痛包括带状疱疹后神经疼痛和三叉神经痛[1,2]，这说明臭氧治疗神经病理性疼痛效果较好。国内外对医用臭氧在动物实验中对神经病理性疼痛的研究较少，关于臭氧在LPA 诱导的脱髓鞘神经病理性疼痛中的作用尚未见研究报道，臭氧在神经病理性疼痛的具体作用机制目前不明。炎症因子，如肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α) 在神经病理性疼痛启动中的作用也一直被受重视。而髓鞘相关糖蛋白 (myeline-associated glycoprotein, MAG) 在髓鞘的形成和维持中也发挥着关键的作用。本研究将探讨单次椎间孔注射 (intervertebral foramen injection, IVF) 臭氧在LPA 脱髓鞘神经病理性疼痛模型中对TNF-α 及MAG 表达的影响。

方 法

1. 实验动物

本研究采用健康成年雄性小鼠（体重20～24 g），动物由南华大学动物中心提供。室温保持50%～60%的湿度和在22±2℃，12 h/12h 黑夜-白天循环照明。动物在安静环境中分笼饲养，能自由摄取食水。所有实验步骤都尽量减轻动物的痛苦并按照有关实验动物的使用原则操作。LPA 脱髓鞘疼痛模型制作：LPA 鞘内注射采用Hylden 和Wilcox等[3]描述的方法，在L5和L6之间的间隙进行。造模后，将小鼠随机分为人造脑脊液组（LPA + aCSF组）及臭氧组（LPA + O3组），椎间孔臭氧或aCSF 注射按照Ferrari 等[4]描述的方法，在L5左侧椎间孔处注射。于注射LPA 前 (t0)、注射LPA 后24 h且注射臭氧或aCSF 前(t1)、注射臭氧或aCSF 后24 h (t2)、3 天 (t3)、7 天 (t4)、14 天 (t5)时测定小鼠机械缩足反射阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)及热缩足反射潜伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)，每组8 只，共48 只，并在不同时间点(t0、t1、t2、t3、t4) 取其背根神经采用Western blot 方法测定MAG、TNF-α 的表达变化，每组3 只，共30 只。

2. 动物行为学测定

（1）MWT 测定：机械痛敏测试装置为透明的有机玻璃箱，无底，箱底为金属网制成（网格为6 mm×6 mm）。在动物行为学测试前为了消除心理因素，把小鼠首先放入有机玻璃箱适应1 h，直至小鼠搔抓、洗脸、行走等活动完全停止，处于安静状态时为止。用传感器指针（美国IITC 电子vonFrey 测痛仪 1601）通过网格垂直刺激小鼠左后肢的足心部。引起小鼠左后肢回缩的压力值即定义为MWT。设定20 g 的压力值为分界点，避免组织损伤，以10 min 的间隔对左后肢重复测量3 次，3 次的均值用于最后的统计学分析。

（2）TWL 测定：热痛敏的测试装置为有机玻璃箱，无底，箱底为可以加热的玻璃平板。在动物行为学测试前为了消除心理因素，把小鼠首先放入有机玻璃箱适应1 h，直至小鼠搔抓、洗脸、行走等活动完全停止，处于安静状态时为止。将热刺激器（美国IITC）放在玻璃平板的下面，投射光源的焦点正对小鼠的左后肢的足心部。通过热刺激器上的镜子可以看到小鼠的脚底面。设定20 s 为界点，避免组织损伤。以10 min 的间隔对左后肢重复测量3 次，3 次的均值用于最后的统计学分析。

3. 给药方法

LPA 是由人工脑脊液 (aCSF: 125 mM NaCl, 3.8 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 10 mM glucose, pH 7.4) 溶解。鞘内注射是采用Hylden 和Wilcox等描述的方法。以左掌压住鼠身，拇、中指按住腰骶部两侧固定，食指按在双侧骶骨前缘连线正中点（可触及L5棘突）指示进针点, 以微量注射器自L5和L6之间的间隙进针。臭氧注射按照Ferrari 等描述的方法。以微量注射器在L5左侧椎间孔处注射30 μg/ml 臭氧 30 μl。

4. Western 印迹法测定MAG 和TNF-α 表达

取出不同时段、臭氧和aCSF 处理后的小鼠L4-5双侧背根神经节，切割成四等份，按重量分别加入Tris 裂解缓冲液（50 mMTris-Hcl, PH6.8; 2%SDS; 10%甘油；ddH2O。使用前要加蛋白酶抑制剂），低温匀浆，超声破碎，1 5000 rpm 低温离心后取上清液。用Micro-BCA (Micro BCA Protein Assay Kit pierce) 法测定蛋白浓度。取等量蛋白样品(20 μg)加入2 μl 上样缓冲液，混匀后，沸水煮沸10 min。取煮沸后的等量蛋白样品约30 μl，加入SDS-PAGE胶孔中，于80 V 恒压，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后浓缩胶电泳60 min，再100 V 恒压，分离胶电泳90 min。将完整的凝胶取下，转移到铺着海绵和滤纸转移夹中组成“三明治”结构，把事先在转移缓冲液中浸泡10 min 的PVDF 膜 (Millipore Japan) 紧贴其上，排除气泡，再在转移缓冲液中380 mA 恒流转移90 min。取出PVDF 膜，在TBS 中轻摇5 min，用封闭液（TBST, 5%w/v 脱脂奶粉）25℃封闭2 h在10 ml 一 抗 [anti-MAG (1:500, Chemicon, USA) , anti-TNF-α (1:1000, Sigma USA)] 稀释液中(TBST, 5%w/v BSA)把PVDF 膜和一抗共同轻摇孵育，4℃过夜。次日，用TBST 清洗PVDF 膜3 次，每次10 min。然后用10 ml 过氧化物酶标记的二抗[anti-MAG (1:500, Chemicon, USA) anti-TNF-a (1:1000, Sigma, USA)] 孵育, 25℃2 h 。用TBST 清洗PVDF 膜，洗脱3 次, 每次10 min，后用1 ml ECL (Pierce chemical, USA) 室温孵育3 min。排出过量液体，在暗室中使其与X 光片(Kodak, Rochester, NY)紧密接触，使X 光片感光数秒到数分钟。显影，定影，冲洗，晾干，扫描并进行计算机图象分析。PVDF膜用strip 液50℃洗脱30 min 后重新封闭及加一抗二抗，以β-tubulin [rabbit anti-ß-tubulin polyclonal antibody (Santa cruz USA) 1:500] 作为内参确认上样量基本相同。

图1 热阈值和机械性阈值(n = 8, ±SD) (A) 不同组之间的热缩足反射潜伏期变化的比较；(B) 不同组之间的机械缩足反射阈值变化的比较 *P < 0.05，与LPA-aCSF 组相比；t0：注射LPA 前；t1：注射LPA 后24h 且注射臭氧或aCSF 前；t2：注射臭氧或aCSF 后24 h；t3：3 天；t4：7 天；t5：14 天Fig. 1 Thermal withdrawal latency and mechanical withdrawal threshold (n = 8, ±SD) (A) The comparison of thermal withdrawal latency (TWL) in two groups; (B) The comparison of mechanical withdrawal threshold (MWT) in two groups *P < 0.05, compared with the group LPA-aCSF. t0: befeore LPA injection; t1: 24 h after LPS injection and before O3 or aCSF injection；t2: 24 h after O3 or aCSF injection; t3: 3 days; t4: 7 days; t5: 14 days.

5. 统计学分析

针对行为学缩足阈值的评估，采用Graph Pad Prism 7.0 软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±SD)表示，采用双因素方差 (twoway ANOVA) 分析。P< 0.05认为差异有统计学意义。Western-blotting 的结果：胶片用imageJ 进行条带密度分析，采用双因素方差(two-way ANOVA) 分析。P< 0.05 认为差异有统计学意义。

结 果

1.小鼠热阈值及机械性阈值的变化

两组鞘内注射LPA 后24 h，MWT 和TWL 均明显降低，LPA + O3组与LPA + aCSF 组相比，椎间孔注射臭氧后24 h 时MWT 和TWL 显著上升，疼痛缓解，一直持续至第7 天（P< 0.05，见图1）。

2. 注射人造脑脊液和臭氧后背根神经TNF-α 表达的变化

在 椎 间 孔 注 射aCSF 后24 h (t2)、3 天 (t3)，观察到LPA + aCSF 组背根神经TNF-α 表达较注射aCSF 前 (t1) 变化不大，7 天 (t4) 时表达有所下降；LPA + O3组在O3注射后24 h (t2)，观察到背根神经TNF-α 表达较LPA + aCSF 组明显下降，3 天 (t3) 时最低，维持至第7 天（P< 0.05，见图2）。

3. 注射人造脑脊液和臭氧后背根神经MAG 表达的变化

LPA + aCSF 组在椎间孔注射aCSF24 h 后 (t2)，观察到背根神经MAG 的表达较注射aCSF 前 (t1)明显下降，第3 天 (t3) 时持续下降，而第7 天 (t4) 与第3 天 (t3) 无明显变化；LPA + O3组在O3注射24 h (t2)、3 天 (t3) 时，观察到背根神经节MAG 的表达较LPA + aCSF 组明显增高，维持在注射臭氧前水平，仅第7 天 (t4) 时MAG 表达较注射臭氧前出现轻微下降（P< 0.05,见图3）。

图2 注射人造脑脊液和臭氧后背根神经TNF-α 表达的变化 (A) 用ß-tubulin 标化后两组TNF-α 蛋白定量的统计图；(B) 两组不同时间点TNF-α 的Western blot结果 *P < 0.05,与LPA + aCSF 组相比；t0：注射LPA前；t1：注射LPA 后24 h 且注射臭氧或aCSF 前；t2：注射臭氧或aCSF 后24 h；t3：3 天；t4：7 天；t5：14 天Fig.2 The expression of TNF-α protein in aCSF and LPA + O3 group (A) Statistical graph of TNF-α protein quantification in two groups after ß-tubulin standardization；(B) Western blot results of TNF-α in two groups at different time points. *P < 0.05, compared with group LPA + aCSF. t0: befeore LPA injection; t1: 24 h after LPS injection and before O3 or aCSF injection; t2: 24 h after O3 or aCSF injection; t3: 3 days; t4: 7 days; t5: 14 days.

图3 注射人造脑脊液和臭氧后背根神经MAG 表达的变化 (A) 用ß-tubulin 标化后两组MAG 蛋白定量的统计图；(B)两组不同时间点MAG 的Western blot结果 *P < 0.05,与LPA + aCSF 组相比；t0：注射LPA前；t1：注射LPA 后24 h 且注射臭氧或aCSF 前；t2：注射臭氧或aCSF 后24 h；t3：3 天；t4：7 天；t5：14 天 Fig. 3 The alterations of MAG protein in aCSF and LPA + O3 group (A) Statistical graph of MAG protein quantification in two groups after ß-tubulin standardization; (B) Western blot results of MAG in two groups at different time points. *P < 0.05, compared with group LPA + aCSF. t0: befeore LPA injection; t1: 24 h after LPS injection and before O3 or aCSF injection; t2: 24 h after O3 or aCSF injection; t3: 3 days; t4: 7 days; t5: 14 days.

讨 论

医用臭氧是臭氧和氧气的混合物, 应用于临床治疗已有100 多年的历史。臭氧具有强烈的刺激性气味[5]，在常温下半衰期约20～30 min，数小时后自然分解。臭氧具有很高的能量, 很快自行分解为氧气和具有很强氧化能力的单个氧原子。在欧洲、俄罗斯和中国，臭氧对于治疗慢性疼痛有很好的可信度和治疗效果，臭氧已经广泛用于治疗各种形式的疼痛[6～8]。臭氧具有抗炎、抗氧化及镇痛的作用。另一方面，在临床上我们通过皮内或神经节注射臭氧发现可以减轻带状疱疹后神经疼痛和三叉神经痛病人的疼痛症状[1,2]。在1 例5 年带状疱疹后神经痛病人的随访研究中，通过在疱疹节段的椎间孔注射臭氧发现可以减轻病人的自发性疼痛和触觉诱发痛[9]。本研究通过在L5左侧椎间孔单次注射臭氧，发现小鼠的机械痛敏及热痛敏1 天后就明显下降了，且维持到了第7 天，这与Lu 等[10]在坐骨神经压迫模型中发现不同浓度及剂量臭氧减轻神经病理性疼痛的时间点有很大的相似性，说明了单次剂量的臭氧可以维持很长时间。而且在LPA 脱髓鞘动物模型中的研究与Luo 等[9]发现的椎间孔注射臭氧可以减轻触觉诱发痛是一致的，虽然维持时间未达到28天。但是关于不同浓度臭氧及不同剂量臭氧在LPA 脱髓鞘神经病理性疼痛中的作用，需要我们进一步去探索。

TNF-α 是神经损伤以及神经炎症过程中最重要及最早释放的致炎细胞因子。在本研究中我们通过单次椎间孔注射臭氧后，观察到背根神经TNF-α 的表达在注射后12 h 立即表达下调，24 h 下降达到峰值，并维持到第3 天，这证实了在LPA 脱髓鞘神经病理性模型中臭氧对TNF-α 有明显的调节作用。但维持时间较短，这可能与臭氧注射方式的不同及臭氧浓度的不同相关。LPA 启动神经病理性疼痛的一个机制是诱导外周神经的脱髓鞘。髓鞘不仅仅对神经动作电位的快速传导是必需的，还对维持轴突的完整性是非常重要。MAG 是一种跨膜的糖蛋白，选择性的固定于外周施旺细胞和中枢少突胶质细胞髓磷脂鞘的轴突外周（结旁区paranode)，因此认为其介导胶质细胞和轴突之间的信号传递[11]。Päiväläinen 等[12]在离体实验当中证实了MAG 在髓鞘形成当中的表达要早于MBP，所以我们认为 MAG 在髓鞘的形成和维持中发挥着重要的作用。另外，我们前期的试验研究证实单次鞘内注射LPA24 h 后背根神经MAG 明显的下降，一直持续到第3 天，这也直接说明了MAG 的降解参与了LPA1 受体诱导的背根神经脱髓鞘[13]。在本次试验中。我们通过同节段L5左侧椎间孔单次注射臭氧，发现背根神经MAG 的表达未明显下降，且可以维持MAG 表达不变到第3 天，直到第7 天的时候才出现下降。这说明臭氧能维持MAG 的完整，第7 天时候的下降与LPA 引起MAG 下降的固有维持时间有关系。之前我们的实验研究证实LPA诱导MAG 下调是通过钙蛋白酶通路来调节，是否臭氧通过抑制上游的钙蛋白酶来保持MAG 表达不变，这是我们需要思考和进一步研究的。另外，在LAP 诱导的脱髓鞘模型中，我们还观察到MBP、PMP22、和MPZ 等髓鞘蛋白降解，臭氧是否能抑制这些髓鞘蛋白的降解，这也是我们需要进一步探讨的。有文献报道RhoA 信号通路是调节神经轴突再生的主要信号通路。抑制Rho 信号通路对于促进轴突再生, 减少细胞死亡, 改善中枢神经系统损伤及引起的疼痛, 是一种很好的方法。而转录因子对于髓鞘形成的调节包括正性调节和负性调节。Parkinson等[14]2004 年在体外实验中证实了转录因子c-Jun 对施旺细胞的增殖和死亡是必需的，而且在髓鞘形成的时候c-Jun 通过Egr2 下调。近期的研究也证实非甾体类的消炎镇痛药物可通过抑制RhoA 信号通路激活促进神经轴突的再生而减轻脊髓损伤的症状，而臭氧同样具有抗炎作用[15]，所以我们下一步的研究也将进一步阐述臭氧是否能调节上游水平的钙蛋白酶和RhoA信号通路表达来减轻神经病理性疼痛。

本研究通过探讨臭氧在LPA 脱髓鞘神经病理性疼痛中对TNF-α 和MAG 表达的影响来进一步阐述臭氧在神经病理性疼痛中的具体作用机制，证实了臭氧能减轻神经病理性疼痛，是治疗神经病理性疼痛的一个很好的方法。