杨树叶片结构与抗锈菌侵染的相关性*

沈阔程 陈倩文 齐 梅 彭子嘉 樊军锋 余仲东

(1.西北农林科技大学林学院 杨凌712100； 2. 中国科学院植物研究所 北京100093)

杨树(Populus) 是重要的速生造林树种，广泛用于风沙治理、防止水土流失、涵养水源等方面。同时杨树也是现代生物质能源的重要树种之一，用于能源化工、木材制浆业(Boyleetal., 2010; Xiaetal., 2017)。松杨栅锈菌(Melampsoralarici-populina)所引起的杨树叶锈病严重影响着杨树生长发育，导致杨树过早落叶并延迟翌年的萌发，缩短杨树生长周期导致杨树后期木材生长不足和木质化不良，造成严重的经济损失(Freyetal., 1997)。杨树锈病可严重阻碍杨树的生长，其中根冠降低可达17%～46%，叶干质量降低21%～66%，直径生长降低1%～35%(Stochlovaetal., 2016)。此外，叶锈病还会破坏杨树自身防御系统，使其遭受虫害、冻害、根部或干部病害等灾害。叶锈病的发生严重影响杨树的健康生长，已成为制约杨树人工林产业的重大问题(Barresetal., 2008; Wanetal., 2013; Persoonsetal., 2014)。

松杨栅锈菌是典型的长史型锈菌，生活史包括5个孢子堆阶段(Wanetal., 2015; Ullahetal., 2017)。其中，夏孢子阶段对杨树具有反复侵染的特点，危害性最强。循环侵染中夏孢子萌发长出芽管，芽管在叶表蜡质层上匍匐生长并通过气孔侵入到叶片，分化形成侵染丝侵入气孔下囊。侵染丝在叶肉组织内进一步分化形成初生菌丝。初生菌丝细胞表面具有可识别杨树叶肉细胞信号的功能，导致菌丝与叶肉细胞相互作用，形成吸器母细胞，并最终发育成吸器，建立活体专性寄生关系(Finketal., 1991； Allenetal., 1991)。目前，针对松杨栅锈菌的研究大多集中在寄主杨树的防御信号的传导、细胞壁的强化、局部细胞的死亡程序、R、Mer、Rus杨树抗病基因功能验证(Dowkiwetal., 2004)等方面。但大量研究表明，杨树固有的结构特征对抵抗其入侵也同样具有重要作用，可视为林木在抗锈病侵染中的第一道防线。田呈明等(2001； 2002)研究发现，杨树叶片气孔的大小及密度等叶表特征会影响寄主对叶锈病的抗性； Pambou等(2018)认为，杨树叶片蜡质的形态、硬度、疏水性等物理性质对松杨栅锈菌侵染具有重要的调节作用。本研究通过调查29种无性系杨树抗锈病的差异，并进一步采用光学显微镜、扫描电镜、透射电镜，观察并分析了叶片物理结构与抗锈性的相关性，为杨树抗锈病品种的快速筛选提供形态学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料包括29种杨树无性系，其中卜氏杨(Populuspurdomii)、川杨(P.szechuanica)、青杨(P.cathayana)、小叶杨(P.simonii)4种杨树来自秦岭火地塘试验基地，其余杨树无性系来自陕西渭河教学试验站的半同胞家系(藕丹等， 2017)。

1.2 试验方法

2018年9月21日对采自西北农林科技大学秦岭火地塘试验基地的卜氏杨、青杨、小叶杨、川杨无性系进行松杨栅锈菌发病情况调查及叶片采集； 2018年9月25日对西北农林科技大学渭河试验站的25种杨树无性系进行调查及叶片采集。

1.2.1 叶片表面夏孢子堆密度 参考沈阔程(2019)方法，以单位面积叶片上夏孢子堆数目为单位，评估杨树感病程度。

1.2.2 叶片纵切面相关指标测定 参照Yi等(2010)、沈阔程(2019)制作杨树叶片超薄切片，利用透射电镜下测定下表皮细胞厚度、上表皮细胞厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、叶片的总厚度、栅栏组织与海绵组织中细胞密度。

1.2.3 蜡质厚度及下表皮细胞壁厚度测定 参照Wan等(2015)方法制作超薄切片，在透射电镜下测定蜡质厚度与下表皮细胞壁厚度。

1.2.4 活性氧(H2O2)测定 用二氨基联苯胺(DAB，Amresco)对 H2O2的产生位点进行染色，定位在显微镜下观察侵染位点处H2O2情况(Thordal-Christensenetal., 1997； 王晨芳， 2008)。

1.2.5 叶片表面结构相关指标测定 使用干燥法制备样品(Zhangetal., 2005； Jetteretal., 2016)，在扫描电镜下测算相邻气孔间距离、闭合气孔长度、叶片表面蜡质粗糙度。

1.3 数据处理

运用SPSS22.0进行杨树上夏孢子堆密度的Euclidean聚类，运用GraphPad Prism 8.0绘制杨树叶片各指标Violin图，分析其分布。运用GraphPad Prism 8.0绘制指标间的相关性热图。

2 结果与分析

2.1 杨树叶表夏孢子堆密度在无性系间差异性

通过不同无性系杨树叶片间的夏孢子堆密度Euclidean距离进行聚类(图1)。其中毛白杨(P.tomentosa)、银白杨(P.alba)聚为一类，其感病程度为0，无夏孢子堆产生，为非寄主组(Group1)； 69杨(P.deltoidescv. I-69； ♀)与青杨(♂)的杂种一代(F1)、青杨、卜氏杨、小叶杨归为一类，其夏孢子堆密度最大感病程度最为严重，为易感病组(Group2)； 剩余14种无性系杨树感病程度居中单独聚为一类，主要包括69杨、欧美杨(P. ×euramericana)、69杨(♀)与欧美杨(♂)杂种一代(F1)、红叶杨(P.deltoidescv. Zhonghuahongye)等，为抗病寄主组(Group3)。根据各无性系杨树的遗传背景及分派标准，白杨派(Sect.Leuces)杨树为松杨栅锈菌的一种非寄主，单独分支； 青杨派(Sect.Tacamahaca)为松杨栅锈菌的易感病寄主，黑杨派(Sect.Aigeiros)为该锈菌较强抗性寄主。此外，69杨与青杨的杂种一代(F1)抗锈病能力接近青杨派杨树为易感病寄主，69杨与欧美杨杂种一代(F1)抗锈病能力接近于欧美杨的抗性，杂交杨树品种抗锈性受父本的抗锈性影响大。

图1 不同无性系杨树松杨栅锈菌夏孢子堆密度系谱Fig.1 Cluster map based on uredinial density in different poplar clones69青、69欧分别表示母本♀为69杨，父本♂为青杨和欧美杨的杂种一代(F1)； 其中，父本♂花粉分别是2008年采自秦岭东部、中部、西部的混合花粉，并由 1、2、3表示。Both P. deltoides cv. I-69× P. cathayana and P. deltoides cv. I-69× P. ×euramericana mean P. deltoides cv. I-69 is maternal, P. cathayana and P. ×euramericana are paternal; the pollen of P. cathayana and P. ×euramericana was collected in 2008 from the eastern, central and western Qinling Mountains, and marked as 1,2,3, respectively.

2.2 杨树叶片组织结构差异性分析

下表皮细胞壁厚度、蜡质厚度、蜡质粗糙度、闭合气孔长度在2.1所分的3类不同感病程度杨树群体间均具有显著的差异(图2)，其中青杨派易感病组(Group3)的蜡质厚度及下表皮细胞壁厚度最小，白杨派非寄主杨树(Group1)的最大，黑杨派抗病寄主组(Group2)居中。在寄主杨树中，青杨派易感病组(Group3)的上表皮细胞厚度显著小于黑杨派抗病组(Group2)； 寄主杨树(Group2、Group3)中，叶片总厚度、下表皮细胞厚度、海绵组织厚度指标显著大于白杨派非寄主杨树(Group1)； 寄主杨树(Group2、Group3)的栅栏组织厚度、相邻气孔间距离及海绵组织细胞密度指标则显著小于白杨派非寄主杨树(Group 1)。在杨树的感病程度分类中，除川杨被归为抗性寄主外，各无性系杨树叶片结构均与其派别分类和抗性基本相符(图1)。叶片结构指标在3组不同感病杨树群体之间具有较大的离差，其主要原因是根据感病程度所分的组中包含有众多无性系，不同无性系间也具有一定的差异。

图2 杨树无性系叶片结构指标的小提琴图及差异Fig.2 Violin plot of histological index of poplar leaf

综合不同基因背景杨树(所有试验杨树)叶片结构与感染叶锈病的相关性分析表明： 下表皮细胞壁厚度、蜡质厚度与叶表夏孢子堆密度具显著的负相关关系(r=-0.747，-0.473，图3)。闭合气孔长度、栅栏组织厚度、海绵组织细胞密度、下表皮厚度与叶表孢子堆密度具有显著的正相关关系(r=0.577，0.757，0.569，0.720)。69杨与欧美杨杂种F1代半同胞家系中，蜡质厚度、下表皮细胞壁厚度与相邻气孔间距离具有显著的负相关关系(r=-0.431，-0.586)； 海绵组织厚度与叶表夏孢子堆密度呈显著正相关关系(r=0.197)。69杨与青杨的杂种一代(F1)半同胞家系中，下表皮细胞壁厚度、蜡质厚度与叶表夏孢子堆密度也显著的负相关(r=-0.665，-0.245)； 海绵组织细胞密度、相邻气孔间距离与叶表夏孢子堆密度显著的正相关(r=0.182，0.374)。因此，下表皮细胞壁厚度、蜡质厚度在所有试验杨树中均与叶表夏孢子堆密度具有显著的负相关性(图3)，这表明下表皮细胞壁厚度、蜡质厚度与杨树抗锈病能力具有一个稳定的正相关关系。

在锈菌侵染的过程中，松杨栅锈菌芽管可以通过气孔和已破损的蜡质层直接穿透侵入叶片内部(图4A)。此外锈菌芽管在叶表生长过程中对蜡质层具有一定的溶解作用从而直接穿透蜡质保护层，所以蜡质层的厚度也直接决定着芽管穿透蜡质而侵入的难易程度(图4B)。通过DAB-HCl染色观察到杨树叶肉细胞受到锈菌感染时在细胞壁周围会积累大量的H2O2，抵御锈菌的入侵(图5)。杨树下表皮细胞壁不仅物理防御对锈菌的侵染还通过调节植物的生理生化反应对锈菌同样具有重要的防御作用。下表皮细胞壁厚度、蜡质厚度与抗锈性具有正相关关系。以卜氏杨、毛白杨、69杨为代表，透射电镜显示(图6)： 易感病寄主卜氏杨下表皮细胞壁厚度、蜡质厚度，非寄主毛白杨最大，抗病寄主69杨居中，与下表皮细胞壁厚度、蜡质厚度与抗锈性具有正相关关系的结论相符，进一步证实了该结论的普遍性。

图3 杨树叶片结构指标与感染松杨栅锈菌产生夏孢子堆密度的相关分析Fig.3 Correlation analysis between leaf structure and uredinial density on poplarsA. 29种供试杨树 29 clones of tested poplar; B. 69杨×欧美杨半同胞家系 Half-sib families of P.deltoides cv. I-69 and P. × euramericana; C. 69杨×青杨半同胞家系 Half-sib families of P. deltoides cv. I-69 and P. cathayana.

图4 松杨栅锈菌通过气孔和穿透蜡质层进入叶片内部侵染69杨Fig.4 The infection process of the germ tube via stomata or cuticle on the leaf surface of P. deltoides cv. I-69红色箭头代表通过气孔侵染杨树叶片； 蓝色箭头代表通过破损的蜡质层或者溶解蜡质层而侵入杨树到杨树内部。 Red arrow indicated the germ tubes penetrated by stomata and the blue arrow indicated the germ tube penetrating the cuticle directly or germ tubes merging with each other.

图5 松杨栅锈菌侵染过程中杨树叶肉细胞细胞壁周围积累大量H2O2Fig.5 Accumulation of a large amount of H2O2 around the cell wall of poplar leaf cells during the infection of Melampsora larici-populina

图6 卜氏杨(A)、69杨(B)、毛白杨(C)叶片蜡质及下表皮细胞壁厚度(背面)Fig.6 The thickness of cuticle and lower epidermal cell walls (hypophyllous) of P. purdomii(A), P. deltoides cv. I-69(B) and P. tomentosa(C)

3 讨论

松杨栅锈菌严重影响杨树的生长，已逐渐成为阻碍杨树人工林产业发展的重要因素(Wanetal., 2013)，利用杂种优势筛选抗锈性杨树品种是生产中通用做法。本研究通过对29种杨树无性系发病情况调查发现，杂交种的抗锈性主要来自其父本的抗性差异，且不同派别杨树及其杂交杨无性系对松杨栅锈菌抗性具有显著的不同，其中青杨派杨树及其杂交品种为易感病寄主，黑杨派杨树具有较强抗锈性，白杨派杨树为松杨栅锈菌的非寄主。Stochlova等(2016)与Pinon等 (2006)报道的黑杨派与青杨派杂种叶表疏水性较低，更贴近于青杨派树种，致使叶表湿度显著提高有利于锈菌夏孢子的萌发与侵入。黑杨派与青杨派杂种在不断的与黑杨派杨树回交过程中，其抗锈病能力与叶表湿度均显著提高，从而使杂交种在抗锈性上更接近黑杨派树种。本研究也发现黑杨派69杨与青杨派青杨的杂种一代表现有较强的感病能力。在叶片组织结构差异性分析中，寄主杨树下表皮厚度、海绵组织厚度、叶片总厚度均显著大于非寄主杨树。锈菌在叶表萌发后，芽管通过气孔或者直接穿透方式侵入到叶片内部，主要在下表皮细胞和海绵组织细胞中形成吸器吸取营养。在同种杨树上，叶片海绵组织厚度较厚者可提供充足的营养成分，致使产孢量增加，发病加重(康振生等,1993; 唐志鹏,2006; 李琴, 2010; Yuetal.,2011; 田呈明等,2001)。锈菌在非寄主植物上不能成功建立寄生关系并形成吸器，故寄主杨树与非寄主杨树抗锈病能力差异并不是下表皮厚度、海绵组织厚度、叶片总厚度间的差异所致(Newcombe,2005; Bettgenhaeuseretal.,2014; Wanetal., 2015)。

在叶片结构与抗锈病的相关分析中，不同基因背景杨树中有6个叶片结构指标与抗病性具有显著的相关性。而在基因背景相近的69杨与欧美杨杂种一代半同胞家系中有3个结构指标与抗锈病具有相关性，69杨与青杨杂种一代半同胞家系中有4个结构指标与抗锈病相关，但共性指标仅有蜡质厚度和下表皮细胞壁厚度，其他非共性指标可能来自不同杨树间的固有差异但与抗锈病并无稳定的相关性。杨树叶片气孔密度和大小间的差异与锈菌侵染是否具有相关关系一直存在着争议。有研究者认为，锈菌主要通过气孔侵入到叶片内部，较大的气孔密度与较大的气孔结构可以增加病原菌侵入到叶片内部的机会，同时也可提高叶片蒸腾速率，加大叶表湿度，促进病原菌的生长(Russinetal., 1997; Heath, 2002; Nicolasetal., 2018)。另一些研究认为芽管通过气孔入侵是一个随机过程，未发现芽管对气孔的趋向性； 并且气孔直径一般为20 μm左右远大于芽管的直径(2～6 μm)，均可以保证芽管的顺利侵入(Hochetal., 1987; Haworthetal., 2018; Yangetal., 2014)。本研究发现，除69杨与青杨的杂种一代(F1)外，叶片气孔密度和大小与抗锈病能力并不具备稳定可靠的相关性，但在所有试验杨树中叶片下表皮细胞壁厚度及叶表蜡质厚度与抗锈性间均显示稳定可靠的正相关性，可在生产实践中用做快速筛选抗锈病杨树的指标。芽管还可以通过直接穿透蜡质方式侵入叶肉组织，而蜡质作为抵御侵染的第一道防线，其厚度的增加可直接增强叶表蜡质硬度，使叶片抵御芽管侵入(Yuetal., 2011; Wanetal., 2015)。蜡质除可作为物理屏障也是一种复杂的化合物，其化学组成成分在抑制病原菌侵染方面也具有重要的影响，如拟南芥(Arabidopsisthaliana)蜡质对灰霉病(Botrytiscinerea)和葡萄(Vitisvinifera)藤蜡质对白粉病都具良好的防御效果(Bessireetal., 2007; Özeretal., 2017)； 玉米(Zeamays)粒的果皮蜡质具有抑制黄曲霉菌(Aspergillusflavus)生长的作用(Gembehetal., 2001)。但杨树叶片蜡质抵御松杨栅锈菌侵染的作用机制目前仍不清楚，并且研究发现在锈菌的吸器母细胞形成过程中，表皮细胞壁会积累大量超氧自由基、过氧化氢、苯酚及三萜等抑菌物质(Heath, 2000； 2002)，因此，蜡质厚度与抑菌物积累在杨树抗锈性调控作用中的地位和关系仍需进一步研究。

4 结论

本研究通过29种不同杨树无性系对松杨栅锈菌的感病程度调查分析得到： 青杨派杨树为易感病寄主，黑杨派杨树虽也为松杨栅锈菌寄主但具有较强抗性，白杨派杨树不受松杨栅锈菌的侵染为非寄主类； 69杨与青杨的杂种一代(F1)半同胞家系杨树感病性与青杨相似，69杨与欧美杨杂种一代(F1)半同胞家系感病程度与欧美杨相似，说明杂交杨树抗锈病能力受父本影响更为显著。杨树叶片结构差异性分析中，寄主杨树海绵组织细胞密度、相邻气孔距离及栅栏组织厚度则显著小于非寄主杨树； 而下表皮厚度、叶片总厚度、海绵组织厚度显著大于非寄主杨树。在寄主杨树中易感病组上表皮厚度显著小于抗病组。在所有试验杨树综合分析中发现，杨树下表皮细胞壁厚度及叶表蜡质厚度与杨树抗锈病性具有一个稳定可靠的正相关性，因此在实际生产实践中可通过这2个形态指标快速筛选抗锈病杨树。