炎可宁片含量测定方法的研究进展

李亚，熊英，黄鹏，普俊学

炎可宁片为《卫生部药品标准》收载品种，为常用中成药之一，由黄柏、大黄、黄芩、板蓝根、黄连5 味中药制成，具有清热泻火、消炎止痢的功效，临床用于急性扁桃腺炎、细菌性肺炎、急性结膜炎、中耳炎、疖痈瘰疠、急性乳腺炎、肠炎、细菌性痢疾及急性尿道感染的治疗。有关炎可宁片成分研究的文献较多，主要为对处方中各药味单一或多个指标成分进行含量测定的方法研究，为了使炎可宁片的质量得到进一步的控制，本文简要综述了炎可宁片含量测定方法的研究进展，以期为炎可宁片的质量控制提供一定帮助。

1 高效液相色谱法

高效液相色谱法是一种高效、高灵敏度、易回收的分析分离技术，广泛应用于中药以及中药制剂中多成分、微量成分的含量测定。本文中关于炎可宁片含量测定主要涉及的是分配色谱中的液-固色谱，通过配制一定浓度的对照品和供试品溶液，在平行条件下，测得供试品和对照品溶液的响应信号（吸收峰面积），采用外标法得出待测物的含量。

1.1 盐酸小檗碱 盐酸小檗碱又称黄连素，是一种异喹啉生物碱，主要来源于黄柏、黄连、三颗针，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、降血糖、降血压等药理作用［1］。现代药理研究表示，该成分可抑制生物膜的形成，起到广谱抗菌作用，同时抑制白细胞与内皮细胞的黏附，减少炎性反应［2-3］。

制剂生产中，黄柏以水煎提取后醇沉成稠膏入药，受初膏浓度、温度、醇料比等条件［4-5］的影响，盐酸小檗碱易损失。因此盐酸小檗碱除了能影响炎可宁片的药效外，还能反映制剂工艺的提取、纯化情况，是炎可宁片的质量控制指标之一。

盐酸小檗碱多以游离态存在，为增大其提取率，一般用盐酸与甲醇的配比溶液对样品进行超声提取。张飞［6］在研究炎可宁片中盐酸小檗碱的提取时，分别采用配比为500 ∶1和100：1 的甲醇-盐酸溶液对炎可宁片中的盐酸小檗碱进行提取，前者的提取效率优于后者。

周静安［7］建立了反相离子对色谱法测定盐酸小檗碱的含量，以庚烷磺酸钠作为反离子对，Shim-pack VP-ODS（200 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，乙腈-磷酸盐缓冲液为流动相，得出盐酸小檗碱的线性范围为16.0～128.0 μg/ml。该方法获得的盐酸小檗碱含量真实，但不能完全反映主药黄柏的质量。

田军等［8］对研细后的炎可宁样品以稀乙醇为溶液进行超声提取，色谱柱为 C18 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相0.05 mol/L 磷酸二氢钠（使用磷酸调节pH 至3）：乙腈（70 ∶30），检测波长为210 nm。结果显示，对照品与供试品的峰皆在19.1 min 出现，且阴性对照显示无干扰，专属性强。

陈进等［9］和袁梦哲等［10］将样品除去包衣后用盐酸-甲醇（1 ∶100）溶液超声处理，并经中性氧化铝柱洗脱分离，两者皆使用C18 作为固定相，乙腈与磷酸二氢钾的配比溶液作为流动相。为较大程度地除去干扰，可考虑在之后的盐酸小檗碱研究中使用碱性氧化铝进行样品的前处理［11］。

宋冬梅等［12］和姜范成等［13］皆使用乙腈-0.1%磷酸溶液（50 ∶50）为流动相；前者采用Inertsil ODS-3，检测波长为345 nm。后者采用Welch Plus-C18 作为色谱柱，测定波长为265 nm。两者在流动相中加入了十二烷基磺酸钠，其阴离子形式可与被测组分离子结合，可提高分离度，优化分析效果。实际所得盐酸小檗碱含量与根据药典进行分析所得理论含量不同，仅为其一半，推测可能原因之一是黄柏在经水提醇沉的过程中丢失了部分盐酸小檗碱，二是当时2015 版药典仅对味连有限度要求，因此黄连来源会影响盐酸小檗碱含量。现2020 版药典补充了雅连、云连的限度要求，由此可减少品种变换所造成的含量差异。

1.2 黄芩苷 黄芩苷是黄酮类化合物，具有抗菌、抗氧化、抗病毒和抗癌等药理作用［14-15］。其通过直接作用于免疫细胞，抑制炎症细胞因子，起到抗炎作用［16］，但其在体内的生物利用度偏低［17］，为炎可宁片的质量控制指标之一。

周静安［18］通过设置不同的提取时间、柱温、流动相中乙腈与磷酸的配比进行试验，发现20 min 的提取时间、30 ℃的柱温、乙腈与0.01%磷酸溶液22 ∶78 的配比，是最佳的测定条件，为之后的黄芩苷测定提供参考。

李铁纯等［19］和伊文敏［20］以Kromasil C18 作为色谱柱，前者以甲醇-水-磷酸（60 ∶40 ∶0.2）为流动相，在280 nm 检测波长处测定黄芩苷的含量；后者在316 nm 检测波长、甲醇-冰醋酸-水（50 ∶1 ∶50）作为流动相的条件下进行测定。黄芩苷的测量应加入阴性对照，验证其结果的真实性。

高长青等［21］以ODS 柱分离黄芩苷，以甲醇-水-醋酸（40 ∶60 ∶1）为流动相进行含量测定。结果显示，黄芩苷在8 min 出峰，且与其他成分峰无重合，黄芩苷在0.25～2.50 μg 时与峰面积呈线性关系，最低检测限为3.7 μg/ml。经验证回收率约为99%，所得含量真实。

张军荣等［22］和鄢长余等［23］以70%乙醇作为溶剂并加热回流30 min 得供试品溶液。两者皆在280 nm 波长下采用外标法分别在Dikma C18、甲醇-水-磷酸（47 ∶53 ∶0.2）和Welch Plus-C18、流动相甲醇-0.2%磷酸水溶液（47 ∶53）的色谱条件下对黄芩苷进行测量。结果显示，通过以上方法测定黄芩苷含量的专属性强，结果真实，重复性好。

1.3 大黄蒽醌类化合物 大黄蒽醌类化合物是大黄的有效成分，多以二蒽醌与苷结合的形式存在，包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚，有抗炎、抗肿瘤、抗纤维化等药理作用［24］。在大黄蒽醌的提取工艺研究中，一般采用乙醇或甲醇回流提取、稀酸水解，最后三氯甲烷萃取三步骤。该提取方法用于样品前处理能提高柱效和分离效果。

1.3.1 大黄总蒽醌 尹永芹等［25］在色谱柱 Kromasil C18、流动相甲醇-0.1%的磷酸水溶液、检测波长254 nm 的色谱条件下采用梯度洗脱的方法对大黄中5种蒽醌成分进行同时定量，能较全面地反映大黄的质量、提取纯化情况。该作者通过标准曲线法测定总蒽醌含量，显示大黄素和大黄酚所占含量比例较高，易检测，可作为大黄制剂的特征组分。

1.3.2 大黄酚 于远洋等［26］在色谱柱Welch Plus-C18、流动相甲醇-0.1%磷酸溶液（85 ∶15）、测定波长254 nm 的色谱条件下对样品进行测定，色谱图显示大黄酚的保留时间约为6 min，峰形对称，与其他成分无重合，且缺大黄的阴性样品显示无干扰。该方法经方法学验证，适于炎可宁片中大黄酚的测定。

1.3.3 大黄素和大黄酚 刘译［27］对同一厂家10 个批次的炎可宁片成分进行测定。设置色谱条件为：色谱柱Dikma C18；流动相甲醇-水-冰醋酸（80 ∶20 ∶1）；检测波长254 nm，在该色谱条件下，目标物与其他组分峰分离度皆大于1.5，同时该10 批次测得含量相对标准差（RSD）皆小于6%，回收率为98%，结果真实可信。根据该实验的研究结果可得大黄素和大黄酚的含量限度，不低于0.08 mg/片（0.3 g 剂量）。

张大军等［28］对供试品的制备方法进行考察，以成分含量作为指标，发现采用三氯甲烷作为提取溶剂，加热提取，萃取三次以上可使目标物提取完全。在色谱柱Shim-pack C18、流动相甲醇-0.1%磷酸（85 ∶15）、检测波长254 nm 的色谱条件下对样品进行测定，所得图谱特征峰明显，分离度较好。测定结果显示每片含大黄素和大黄酚总量均不少于0.4 mg。

林远凤等［29］以Shimadzu C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，254 nm 为检测波长，对不同组分和配比的流动相进行考察，最后确定甲醇-0.1%磷酸溶液（85 ∶15）为流动相。在该条件下所得成分峰形对称，分离度好。且经方法学考察，大黄素0.586～29.300 μg/ml，大黄酚线性范围为1.581～79.050 μg/ml，两者回收率均接近100%。

汪秀月［30］采用天津兰博C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）作为色谱柱，流动相为甲醇-0.1% 磷酸溶液（85 ∶15），并对大黄素和大黄酚进行测量。磷酸的加入抑制了酚羟基的水解，减少了色谱峰的拖尾。结果显示在该色谱条件下，样品浓度和峰面积有相关性，线性范围宽，大黄素为106.5～535.5 μg/ml，大黄酚为0.207～1.035 mg/ml。

1.3.4 大黄素和大黄酸 有研究采用Venus1lxbp-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱；以乙腈-0.2%磷酸溶液（65 ∶35）为流动相对提取液进行梯度洗脱，增加了待测成分在柱上的保留时间［31］。大黄酸约在3 min 处出峰，大黄素约在6 min 出峰，两者与其他成分峰分离度均大于1.5%，经方法学考察，该法适用于大黄素和大黄酸的测定，但其与其他方法一样忽略了大黄中其他重要成分的测定，不利于对大黄药材进行质量控制。

1.4 板蓝根成分 板蓝根为菘蓝的干燥根，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗内毒素、抗肿瘤等药理作用［32-33］，其成分主要为核苷、有机酸、生物碱等9 类物质，由于板蓝根制剂的水煎煮工艺致使其有效成分破坏较大［34］，含量太低，仪器不足以检测。一般采用含量较大、专属性强的核苷作为板蓝根制剂的测定项［35-38］。

1.5 综合类 有效控制炎可宁片的质量，多采用高效液相色谱法通过改变色谱条件同时对多种成分进行测定，从色谱柱的型号、流动相的组成与比例、检测波长λ、待测成分四个方面归纳如表1［39-43］，除表1 报道的文献外，许学丽等［44］对三个批次炎可宁片中的盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚进行含量测定，色谱柱为InertSustain C18，流动相为甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液，检测波长为254 nm，结果显示盐酸小檗碱与黄芩苷的含量最高，但不同批次含量差异较大，如盐酸小檗碱，三批次含量RSD 大于1（精密性验证良好，排除分析误差），推测可能是样品原料质量不均一引起的含量差异。

表1 炎可宁片中各待测成分HPLC 测定方法比较

2 其他方法

2.1 区带毛细电泳法 区带毛细电泳法［45］在中药分析中分析广泛，可在色谱的基础上，通过电泳对物质进一步分离分析。生物碱在缓冲体系内大多带有正电荷，一般采用区带毛细电泳法在一定pH 值下，加入有机修饰剂，通过毛细管对样品进行分离，根据电泳谱图对样品进行分析。该方法操作简便，分析高效、高速，广泛应用于药品的分离分析检测。

霍鹏等［46］建立了同时用外标法测定炎可宁片中小檗碱、巴马汀、药根碱、大黄素、大黄酸含量的区带毛细管电泳法。用甲醇超声提取样品两次后合并提取液得到供试品，并对电泳条件进行考察，在未涂层弹性石英毛细管中，确定90 mmol/L Tris-10 mmol/LCit（含30%乙腈，pH=8）的缓冲体系、25 kV 的分离电压、8 s 的进样时间为较佳测定条件。该方法分辨率高，便于分离带电离子，但巴马汀和小檗碱由于结构相似，难以达到基线分离。

2.2 超高效液相色谱-串联质谱（UPLC－MS/MS）法 液相色谱（LC）仪器与各种MS 仪器相结合［47-48］，不仅可以提供药物的含量与结构信息，也不要求成分完全分离，且不需要挥发或衍生化，灵敏高效且易操作，具有高效的分离分析能力，还能提供化合物的质量信息，在药学领域被广泛使用。张丹等［49］对炎可宁片中五种药味的指标成分黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷、大黄素的含量进行同时测定。色谱条件：色谱柱 ACQUITY UPLC BEN C18，流动相乙腈-0.1%甲酸；质谱条件：电喷雾离子源，正负离子切换模式扫描，多反应监测模式（MRM）去除干扰信号。该测定方法采用色谱和质谱两种仪器共用分析，通过设置混合对照和阴性对照，准确并高效对炎可宁片的各成分进行测定。

3 结语

经方法学研究考察，各测定方法的线性、重现性以及回收率等均较好，对于炎可宁片的含量测定皆具有可行性。对于炎可宁片成分的含量测定，多采用高效液相色谱法，该方法因灵敏度高、专属性强、检测限低，更适用于炎可宁片的质量控制与分析。

炎可宁片是由多种药味组成的中药复方，方中的各味药都是不可取代的，单一成分并不能如实反映其产品的质量，因此建议结合处方方解，以多成分作为炎可宁片质量的评估指标，以便全面科学地控制药品质量。