腾冲雪鸡mtDNA D-loop 区遗传多样性分析*

王荣琼 ，张自芳，黄 静，钱林东，滕晓红，苗永旺

(1.云南农业职业技术学院 畜牧兽医学院，云南 昆明 650212；2.云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201)

腾冲雪鸡(Tengchong White Chicken)因主产于云南西部的腾冲市且全身羽毛雪白而得名，属肉蛋兼用型地方鸡种[1-2]。该鸡分布于腾冲市高黎贡山西麓的界头、曲石、五合、芒棒、明光和滇滩等乡镇，中心产区在界头和曲石2 个乡镇[1]。产地与缅甸北部接壤，属高黎贡山西麓的丘陵和山区地带，地形地貌复杂，海拔在1 400～2 500 m 之间；当地受孟加拉湾西南暖湿气流影响，呈现典型的立体气候特征。腾冲雪鸡产地森林覆盖率70%以上，草地、草山和林地甚多，农副产品和饲料资源丰富[1-2]，为腾冲雪鸡遗传资源的形成和养殖提供了必要条件。据考证，腾冲雪鸡在当地饲养已有几百年的历史；该鸡是在当地高黎贡山西麓独特的自然环境和生态条件下，与外界长期隔离和闭锁繁育，经当地人民长期的选育形成的[1]。

腾冲雪鸡以放养为主，体型中等，结实紧凑；羽色洁白如雪；皮肤、肌肉和骨骼均为乌色；冠多为单冠，少数玫瑰冠[1-2]。该鸡对当地自然生态条件有良好的适应性，具有耐粗饲、肉和蛋品质佳、抗病力强等优良种质特性，是发展云南养鸡业的宝贵遗传资源[1-2]。腾冲雪鸡是在1995—1997 年全国畜禽遗传资源补充调查时被发现的[2-3]，于2011 年列入《中国畜禽遗传资源志·家禽志》[1]，2015 年列入《云南省畜禽遗传资源志》[1]。

近年对腾冲雪鸡的种质特性已有研究报道，已对该鸡的产地和分布、体型外貌特征、血液生化指标和屠宰性能等有所描述[1-5]。过去采用微卫星DNA 标记对该鸡进行了群体遗传多样性研究[6-7]，但距今已有10 余年的时间，现在该鸡的群体遗传结构如何？外来鸡种对其有无基因渗入？急需进一步对其进行分子水平的遗传评估和遗传监测。本研究利用适合进行种下水平遗传多样性分析的mtDNA D-loop 区序列为遗传标记[8-13]，采用 PCR 产物直接测序技术，并以云南本地其他地方鸡种为对照，对腾冲雪鸡样品进行群体变异检测和群体遗传学分析，阐明了该鸡的群体遗传结构和血统组成，揭示该鸡群体与云南其他本地鸡种存在一定遗传差异。本研究结果可为腾冲雪鸡资源的保种和育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究材料

在云南省腾冲市的界头、曲石、五合和芒棒等乡镇采集了144 只腾冲雪鸡(♂：60，♀：84)的血液样品，每只鸡采静脉血1 mL。由当地畜牧部门专家带领采样，要求具备腾冲雪鸡典型的品种特征、无血缘关系且在分布上具有代表性。

为了更好地评价腾冲雪鸡的遗传多样性状况，本实验室已发表的11 个云南地方鸡群体的647 条mtDNA D-loop 区序列用于与本研究数据进行比较分析[14-19]。

1.2 基因组DNA 的提取

采用酚—氯仿提取法提取基因组DNA，具体方法参照LIU 等[11]的方法。然后，使用Nano-Drop 2000UV-VIS 分光光度计(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)测定其质量浓度和纯度，稀释成100 ng/µL。

1.3 目的片段扩增及序列测定

目的片段扩增及测序所需引物相同，参照FUMIHITO 等[9]的方法，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 体系及操作程序参照LIU 等[11]。PCR 产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向直接测序。

1.4 数据统计分析

所获序列经人工检查核对后，以.seq 格式输出，利用ClustalX 软件进行比对，再采用DnaSP 6 软件进行DNA 序列分析，包括群体多态位点、多态性、基因流、群体间遗传分化和遗传距离等的计算和输出。用MEGA 6 软件估算整个群体的平均遗传多样性，进行单倍型输出和世系的划分，并采用邻接法(neighbor-jointing,NJ) 构建系统发生树。

2 结果与分析

2.1 序列变异分析

本研究扩增片段长539 bp，为家鸡mtDNA D-loop 区第1 高变区序列。去掉两侧测序质量较差的序列后，用于本研究的序列长度为520 bp。序列中T、C、A 和G 平均含量分别为30.2%、29.8%、27.3% 和12.6%；序列A+T 平均含量为57.6%，符合mtDNA 序列特征。序列中共检测到33 个多态位点，约占检测核苷酸位点总数的6.35%，未发现插入/缺失，核苷酸替换主要为转换；转换占1.54%，颠换占0.19%，转换颠换比R 值为9.34。在发现的33 个多态位点中，包含单一信息位点4 个，简约信息位点29 个。群体中共发现21 种单倍型，其中单倍型H02、H03、H08 和H11 在群体中所占比例较多，单倍型频率分别为18.75%，18.75%，11.81%和13.19%。本研究所检测到的突变位点及各单倍型包含的变异位点信息见图1。

图1 腾冲雪鸡mtDNA D-loop 区的多态位点及定义的单倍型Fig.1 Polymorphic sites and defined haplotypes in mtDNA D-loop sequences of Tengchong White Chicken

将本研究腾冲雪鸡的序列与已发表的11 个云南其他地方鸡的647 条mtDNA D-loop 区序列进行联合分析，获得云南各地方鸡群体遗传多样性结果(表1)。在整个云南地方鸡数据集中共发现62 个变异位点，其中单一信息位点8 个，简约信息位点54 个，共确定87 个单倍型。腾冲雪鸡与已检测的云南其他地方鸡相比，群体遗传多样性水平相对较高。

表1 云南12 个地方鸡群体的遗传多样性Tab.1 Genetic diversity in 12 indigenous chickens in Yunnan

2.2 群体遗传分化

将本研究数据与已发表的11 个云南地方鸡数据合并，估算出云南地方鸡平均遗传分化指数(Fst)为0.148 05，群体间基因流Nm=2.88。云南12 个地方鸡群体间的Fst在0.000 0～0.587 4 之间；其中，兰坪绒毛鸡与其他云南地方鸡群体间遗传分化最大，而武定鸡与西畴乌骨鸡、华坪乌骨鸡与他留乌骨鸡和普洱毛脚乌鸡、他留乌骨鸡与普洱毛脚乌鸡间遗传分化最小。腾冲雪鸡与其他11 个地方鸡群体间的Fst在0.018 1～0.341 2 之间，其中，腾冲雪鸡与他留乌骨鸡遗传分化最小，与兰坪绒毛鸡遗传分化最大。基于云南12 个地方鸡群体间的遗传分化指数构建的聚类树见图2。

2.3 系统发育关系与世系组成

用腾冲雪鸡所有样品的mtDNA D-Loop 区序列构建NJ 无根系统树。由图3 所示：在系统树上，所有腾冲雪鸡样品聚为支持率较高(＞85%)的5 个分化世系，分别与LIU 等[11]和MIAO 等[12]定义的家鸡mtDNA 母系世系A、B、E、F 和G相对应。腾冲雪鸡中发现的21 个单倍型(H01～H21)都可以划分到已知的母系世系中，其中H03～H05 属于A 世系，H01 和H02 属于B 世系，H06～H09 属于E 世系，H10～H18 属于F 世系，H19～H21 属于G 世系。本研究及已发表数据的单倍型世系划分及各世系在群体中所占的比例见表2。云南12 个地方鸡群体的mtDNA 母系世系血统含有3～7 个不等，其中，西畴乌骨鸡含有的母系世系最少，而大围山微型鸡的最多。与已检测的云南其他地方鸡相比，腾冲雪鸡群体世系组成与其他鸡种明显不同。

3 讨论

本研究在144 只腾冲雪鸡中发现了33 个突变位点，单倍型多样度为0.890±0.011；核苷酸多样度为0.016 41±0.000 28；群体内遗传距离及整个群体平均多样性均为0.017±0.004。一般核苷酸多样度不受样本含量的影响，是衡量群体遗传多样性的主要指标[10]。在云南12 个地方鸡群体中，兰坪绒毛鸡遗传多样性最低，其次为拉伯高脚鸡；除了他留乌骨鸡外，腾冲雪鸡的核苷酸多样度和群体内遗传距离均高于其他鸡种。与近年已检测的中国一些其他地方鸡种相比[20]，腾冲雪鸡的核苷酸多样度也较高。由此，揭示腾冲雪鸡群体内遗传变异丰富，存在多向选育潜力，这与该鸡种未经系统的现代育种技术选育，是原始地方鸡种的实际情况相一致。该鸡是长期在当地自然环境条件和当地群众表型选择的作用下逐渐形成的。因此，该鸡对当地的生态环境及粗放的养殖条件具有较强的适应性。

图2 基于云南12 个地方鸡群体间的遗传分化指数构建的聚类树Fig.2 Clustering tree constructed by genetic differentiation index between 12 indigenous chickens in Yunnan

表2 云南12 个地方鸡群体的世系血统构成比Tab.2 Clade composition ratio in 12 Yunnan local chickens

群体遗传分化分析显示：云南地方鸡群体间存在不同程度的遗传分化，其中，兰坪绒毛鸡与云南其他地方鸡群体间遗传分化最大。相比而言，腾冲雪鸡与云南其他地方鸡存在的遗传分化也较大；其中，该鸡与他留乌骨鸡遗传分化最小，与兰坪绒毛鸡遗传分化最大。在基于云南地方鸡群体间的遗传分化指数构建的聚类树上，显示腾冲雪鸡与云南其他地方鸡遗传差异较大。这与腾冲雪鸡在形成过程中长期闭锁繁育，与云南其他地方鸡基因交流有限有关。

图3 基于腾冲雪鸡D-loop 序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree constructed by using mtDNA D-loop sequences of Tengchong White Chicken

近年研究显示：家鸡是多个母系起源的，世界家鸡和红原鸡的mtDNA 母系世系可划分为A、B、C、D、E、F、G、H 和I 等世系，其中，A 和B 世系在中国、日本和东南亚等地的地方鸡中普遍存在，C 世系为中国黄淮流域地区地方鸡所特有，F、G 和H 世系为云南及邻近地区地方鸡所特有，而E 世系在印度和欧洲家鸡中出现频率较高[11-12]。本研究发现：以往定义的mtDNA母系世系[11-12]在不同的云南地方鸡中其构成比不一样，揭示这些地方鸡种间存在遗传组成上的差异。值得注意的是，云南及邻近地区特有的F 和G 世系很可能为云南本地起源[11-12]，在本研究的大部分云南地方鸡中有较广泛的分布。腾冲雪鸡样品在系统树上聚为分歧较大的5 个世系，分别与以往研究[11-12]划分的A、B、E、F 和G 世系相对应，表明腾冲雪鸡含有5 个母系血统来源，提示腾冲雪鸡可能是在本地起源的家鸡基础上，经外来血统混入逐渐形成的，也为家鸡多个母系起源的观点提供了证据支持[11-13]。与云南其他地方鸡相比，腾冲雪鸡在母系血统构成上与云南其他地方鸡明显不同，表明具有独特的种质遗传特征。在腾冲雪鸡群体中F、A 和B 世系所占的比例较高，为其主要世系。该鸡群体中云南特有世系F 和G 占38.89%。已有研究结果表明：E 世系为南亚和欧洲家鸡的母系血统来源，是外来商品鸡中普遍存在的血统[11-12]，本研究在腾冲雪鸡群体中发现存在15.28%的E 世系血统，推测该鸡存在欧美来源的鸡种基因渗入。这种基因渗入很可能是由于近年片面追求经济效益，大力推广外来“快大型”肉鸡或高产蛋鸡，导致本地遗传资源受到侵蚀的结果。

4 结论

本研究对腾冲雪鸡mtDNA D-loop 区序列变异进行检测，并结合已发表的云南其他地方鸡数据进行分析，结果揭示腾冲雪鸡群体遗传多样性丰富，存在选育潜力。该鸡母系血统构成特征独特，在遗传组成上含有A、B、E、F 和G 5 个母系血统来源，云南特有的血统F 和G 世系占38.89%；该鸡可能存在一定比例外来商品鸡的基因渗入。在该鸡的保种工作中，建议对其保种群进行遗传鉴定，淘汰外血混入种鸡，并在保种区禁止外来鸡种的引进。