云南省不同地区烟草上TSWV NSs 氨基酸序列分析*

王景文 ，王偲博，陶宏征，高 雪，贾志强，王宇琪，李永忠，刘雅婷

(1.云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；3.云南农业大学 烟草学院，云南 昆明 650201)

烟草产业是云南省的支柱产业[1]。近年来，烟草上斑萎病毒严重，主要症状有叶片褪绿、皱缩、坏死斑和植株萎蔫等，导致局部烟区产量损失在60%以上[2-4]。

正番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV) 属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)[5]，是侵染烟草的恶性病毒之一[6]。2011 年正番茄斑萎病毒被列为世界十大植物病毒之一，仅次于烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)，位居世界第二[7]。TSWV 由三分体基因组结构组成，从小到大分别为S RNA、M RNA 和L RNA[8]。S RNA 正链编码非结构蛋白(nonstructural protein of RNA S，NSs)，互补链编码核壳体蛋白(nucleocapsid，NP)。其中NSs是TSWV 重要的致病因子[9]，既能够协助病毒复制、转录，还可以通过结合siRNA 和dsRNA抑制宿主RNA 沉默、增强其病毒症状[10-12]。目前，针对TSWV NSs 研究较少，本研究通过RTPCR、克隆、转化和测序技术，利用生物信息学软件对课题组前期采集的云南不同地区感染TSWV 的烟草样品与GenBank 公布的五大洲不同国家茄科作物上TSWV NSs 氨基酸序列进行分析；并且对云南不同地区烟草TSWV NSs 氨基酸序列进行选择压力分析，阐明来自不同地理分布的不同寄主上TSWV NSs 氨基酸序列间的遗传差异，为今后TSWV NSs 相关致病机制研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究材料

材料来自课题组前期从云南省玉溪市、昭通市、昆明市、红河州、曲靖市和楚雄州采集并且已经通过鉴定确定感染TSWV 的8 份烟草样品，采集到的烟草症状表现为叶片褪绿、局部坏死、叶片皱缩、坏死斑和植株萎蔫(图1)。

图1 感染TSWV 后的烟草症状Fig.1 Tobacco symptoms caused by TSWV

1.2 研究方法

1.2.1 RT-PCR 扩增、克隆及测序

用TransZol TM Up 试剂盒 (全式金，北京)，根据说明书分别提取云南不同地区8 个烟草样品的总RNA。用PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，大连)进行反转录，获得cDNA。运用Primer 5.0 软件，设计1 对TSWV 的S 全序列扩增引物(F：5′-AGAGCAATTGTGTCATAATTTTATTC-3′；R：3′-AGAGCAATTGTGTCAATTTTATTC-5′)进行S 序列PCR 扩增。20 μL PCR 反应体系：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，PrimeSTAR Max DNA Polymerase (TaKaRa，大连) 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR 反应程序：98 ℃ 20 s；98 ℃ 10 s，50 ℃ 10 s，72 ℃ 3 min，30 个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR 反应完成后，取5 μL产物进行1.2% 的琼脂糖凝胶电泳检测。将获得的PCR 产物按照Bioteke 公司多功能DNA 纯化回收试剂盒说明书进行纯化，采用Lethal Based Fast Cloning Kit (天根，北京)进行克隆转化后将阳性菌液送往铂尚生物技术有限公司进行测序。

1.2.2 生物信息学分析

将铂尚生物技术有限公司测得的云南不同地区8 个烟草样品的序列通过MEGA 7.0 呈现序列信息，通过人工方法除去引物及载体序列，最后获得所扩增的片段核酸序列。在DNAMAN 8.0 软件下将各个片段进行拼接，并且通过人工校正获得它们的S 全序列。运用NCBI ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在线软件分析，获得云南不同地区8 个烟草样品TSWV NSs 氨基酸序列。从GenBank 数据库中检索到来自9 个国家和地区的3 种茄科作物上31 条TSWV NSs 氨基酸序列 (表1)。应用DNAMAN 8.0 软件，进行云南不同地区8 个烟草样品TSWV NSs 氨基酸序列与3 种茄科作物上31 条TSWV NSs 氨基酸序列一致性比对分析；再运用MEGA 7.0 软件通过邻近法 (neighbor joining，NJ) 对其进行遗传进化分析，其中Bootstrap 为1 000 次重复。运用在线软件The Selecton Server (http://Selecton.tau.ac.il)对8 个烟草样品TSWV NSs 氨基酸位点所经历的进化选择情况进行分析。

表1 TSWV NSs 氨基酸序列登录号Tab.1 The accession numbers of amino acid sequences of TSWV NSs

2 结果与分析

2.1 RT-PCR 结果

通过RT-PCR 技术扩增出云南不同地区8 个烟草样品TSWV S RNA 序列，电泳检测条带大小约为2 970 bp (图2)。

2.2 生物信息学分析

2.2.1 NSs 氨基酸序列一致性分析

图2 S 片段扩增PCR 结果Fig.2 The results of S fragment amplification PCR

运用DNAMAN 8.0 软件进行一致性分析，结果显示：云南不同地区8 个烟草样品间TSWV NSs 氨基酸序列一致性高达99.4%～100%。云南不同地区8 个烟草样品与GenBank 公布来自9 个国家和地区的烟草、番茄和辣椒上31 个TSWV NSs 氨基酸序列一致性在93.26%～100%之间；其中云南不同地区8 个烟草样品与来自中国云南的1 份烟草、2 份番茄、1 份辣椒的TSWV NSs 氨基酸序列一致性最高达到97.68%～100%；与地理关系较近的韩国3 份番茄、3 份辣椒上TSWV NSs 氨基酸序列一致性次之，为96.21%～99.14%；而与地理关系较远的保加利亚且寄主同样是烟草样品的TSWV NSs 氨基酸序列一致性最低，达93.26%～96.57%。进一步分析9 个国家和地区烟草、番茄和辣椒上31 条TSWV NSs 氨基酸序列，结果显示：中国烟草(HQ 402595.1)与中国番茄(AEK 28761.1) TSWV NSs 氨基酸序列一致性为100%。

2.2.2 系统发育树分析

采用MEGA 7.0 软件，将云南不同地区8 个烟草样品TSWV NSs 氨基酸序列与GenBank 中9 个国家和地区的烟草、番茄和辣椒上31 条TSWV NSs 氨基酸序列构建系统发育树，结果(图3) 显示：有3 个不同的TSWV NSs 分离物群。第Ⅰ组是来自中国和韩国的TSWV 分离物中NSs，包含烟草、辣椒和番茄寄主；其中，云南不同地区8 个烟草样品与同样来自中国云南烟草、番茄和辣椒TSWV 分离物中NSs 位于同一分支，并且与韩国番茄和辣椒TSWV 分离物中NSs 处于同一大支。第Ⅱ组是来自西班牙、阿尔及利亚和美国的TSWV 分离物中NSs，包含辣椒和番茄寄主。第Ⅲ组是来自南非、土耳其、澳大利亚和保加利亚的TSWV 分离物中NSs，包含烟草、番茄和辣椒寄主。

图3 根据TSWV NSs 氨基酸序列构建的系统发育树Fig.3 The phylogenentc tree based on amino acid sequences of TSWV NSs

2.2.3 选择压力分析

通过The Selecton Server 软件，对云南不同地区8 个烟草样品TSWV NSs 氨基酸位点所经历的进化选择情况进行分析。由图4 所示：云南不同地区8 个烟草样品TSWV NSs 氨基酸所经历的进化没有正向选择位点，都是纯化选择(即负向选择)位点。

图4 TSWV NSs 各个氨基酸位点进化压力Fig.4 Pressure of each amino acid sites of TSWV NSs

3 讨论

本研究结果表明：不同TSWV 分离物中NSs与其地理来源有明显的相关性。TSOMPANA 等[13]对不同地理分布的不同寄主上TSWV编码的5 种病毒蛋白进行系统发育树分析，发现TSWV NSs 与不同地理的分布有关。马小方[14]对不同地理分布的梨和苹果上苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV)编码的外壳(CP)蛋白进行分析发现：ASPV 分离物中CP 分布与寄主有关。另有研究发现：胡葱黄条病毒(Shallot yellow stripe virus，SYSV) 分离物分布与地理分布及寄主都有显著的相关性[15]。本研究通过TSWV NSs氨基酸序列比对分析发现：云南8 个烟草样品分别与中国云南烟草、番茄和辣椒上 4 个TSWV NSs 氨基酸序列一致性最高，而且在系统发育树中聚为同一支；与地理关系较近的韩国番茄和辣椒上 6 个TSWV NSs 氨基酸序列一致性次之，在系统发育树中位于同一大支，说明这2 个国家TSWV NSs 亲缘关系较近；而与地理关系较远欧洲保加利亚同样是烟草分离物的亲缘关系最远。这与TSOMPANA 等[13]的观点相符。但TSOMPANA 的研究仅选取了欧洲和美洲的样本，而本研究除云南不同地区8 个烟草样品TSWV NSs 氨基酸序列以外，还选取了来自5 个大洲9 个国家和地区的31 个TSWV NSs 氨基酸序列，更有力地证明了不同TSWV 分离物中NSs 与其地理来源有明显的相关性。此外，我们选取辣椒、番茄和烟草3 种茄科寄主分析TSWV分离物中NSs 分布与寄主的关系，发现TSWV分离物中NSs 未明显按照寄主聚类，并且在中国茄科作物上发现烟草(HQ 402595.1)和番茄(AEK 28761.1) TSWV NSs 氨基酸序列一致性达到100%，说明不同TSWV 分离物中NSs 与寄主的相关性不大。这也提示我们，不同病毒种群分布的关键影响因子不同。

经典理论表明：若一个基因存在正选择则证明该基因已经开始为了适应环境的巨变有新的功能产生，当基因存在强烈的负选择时，则说明该基因是在稳定保持原有的重要功能[16]。云南不同地区 8 个烟草样品 TSWV NSs 氨基酸序列中未检测到正选择位点，说明在云南不同地区 8 个烟草样品 TSWV NSs 稳定保持了其增强病毒症状、抑制沉默等功能。

4 结论

通过对云南不同地区8 个烟草样品与Gen-Bank 公布来自9 个国家和地区的烟草、番茄和辣椒上31 个TSWV NSs 氨基酸序列进行比对分析，说明不同TSWV 分离物中NSs 与其地理来源有明显的相关性，但跟寄主的相关性不大。再通过对云南不同地区8 个烟草样品间TSWV NSs 氨基酸序列进行比对分析，进一步说明了地理位置相近的地区TSWV NSs 具有更高的亲缘关系，遗传变异小，具有一定的稳定性。云南不同地区8 个烟草样品TSWV NSs 氨基酸序列中未检测到正选择位点，说明在云南不同地区8 个烟草样品TSWV NSs 稳定保持了其增强病毒症状、抑制沉默等功能，未受云南不同地区复杂气候的影响而发生适应性进化，这可能对TSWV 保持强侵染性相关，但仍需进一步研究确定。NSs 是TSWV 重要的致病蛋白，对NSs 序列的分析将为研究TSWV 的致病机制提供理论基础。