头颈鳞状细胞癌中HSDL2的表达水平及临床意义

王艺璇，王馨悦，林贞花，孙 洁，杨 洋，金爱花

头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)是指由口腔、口咽、喉部和下咽的鳞状上皮细胞形成的一组恶性侵袭性肿瘤[1]，其发病率占头颈部肿瘤总发病率的95%以上[2]。由于HNSCC发病的高隐匿性、高转移性以及缺乏有效的早期诊断标志物，患者的5年生存率仅40%～50%[3-4]。因此，探寻HNSCC的早期诊断标志物刻不容缓。人类羟基类固醇脱氢酶样蛋白2(hydroxysteroid dehydrogenase like 2, HSDL2)作为短链脱氢酶/还原酶(SDR)超家族中的成员之一，在乳腺癌[5]、甲状腺乳头样癌[6]、卵巢癌[7]和胃癌[8]等多种恶性肿瘤中异常表达且发挥重要作用。目前，关于HSDL2在HNSCC中的表达尚未见报道。本文旨在探讨HSDL2在HNSCC中的表达及临床意义，为筛选HNSCC的早期诊断标志物和药物治疗靶点提供可能的分子生物学指标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1临床资料 组织芯片购自西安艾丽娜公司，包括61例HNSCC组织标本和11例癌旁正常组织标本。61例HNSCC中男性51例，女性10例；年龄<60岁者34例，≥60岁者27例；有淋巴结转移者19例，无淋巴结转移者42例；组织分化程度：高分化16例，中分化32例，低分化13例；临床分期：Ⅰ+Ⅱ期28例，Ⅲ+Ⅳ期33例。

1.1.2主要试剂 HSDL2抗体购自美国Proteintech公司(15631-1-AP)，免疫组化SP两步法试剂盒、柠檬酸缓冲液、PBS缓冲液、DAB显色剂和苏木精染料，均购自北京中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1生信分析 应用UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)[9]分析HNSCC组织和正常组织中HSDL2 mRNA的表达及其与临床病理特征的关系；应用HPA数据库(https://www. proteinatlas.org/)[10]分析HSDL2蛋白(抗体编号HPA050453)在HNSCC组织和癌旁正常组织中的表达水平及其与患者总生存期的关系；应用STRING数据库(https://string-db.org)[11]分析HSDL2的蛋白互作网络及其可能参与的生物学进程。

1.2.2免疫组化 采用免疫组化SP两步法检测HSDL2蛋白的表达水平，60 ℃烤片45 min，常规脱蜡，梯度乙醇水化，热柠檬酸盐缓冲液水浴30 min进行抗原修复，滴加一抗HSDL2(稀释浓度为1 ∶200)，4 ℃孵育过夜；次日，辣根过氧化物酶标记二抗，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照组。

1.3 结果判断以细胞质内出现棕褐色颗粒为HSDL2蛋白阳性染色。(1)根据细胞染色强度计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。(2)根据阳性细胞所占百分比计分：0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。将两项评分相乘作为最终得分：0分为(-)，1～4分为(+)，5～8分为()，9～12分为()。其中≤4分为低表达，>4分为高表达。

1.4 统计学分析所有数据使用SPSS 25.0软件进行分析，HSDL2表达与临床病理特征的相关性分析，采用χ2检验或Fisher精确检验法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HNSCC组织中HSDL2 mRNA的表达通过UALCAN数据库分析520例HNSCC组织和44例正常组织中HSDL2 mRNA的表达水平，结果显示：与正常组织相比，HSDL2 mRNA的表达水平在HNSCC中显著降低(P<0.01，图1A)。进一步分析HSDL2 mRNA的表达水平与临床病理特征的关系，发现其与HNSCC临床分期和淋巴结转移密切相关(P<0.05)：HSDL2 mRNA在临床分期Ⅰ～Ⅳ期HNSCC组织中的表达水平显著低于正常组织(图1B)；HSDL2 mRNA表达水平从淋巴结转移的N1～N3期呈逐渐降低趋势(P<0.05，图1C)。本组HPV阴性HNSCC组织中，HSDL2 mRNA表达水平亦显著低于正常组织和HPV阳性HNSCC组织(P<0.01，图1D)，提示HSDL2与HNSCC的恶性演进密切相关。

图1 UALCAN数据库检索HSDL2 mRNA的表达：A.HSDL2 mRNA在正常组织和头颈鳞状细胞癌组织中的表达；B.HSDL2 mRNA表达水平与临床分期的关系；C.HSDL2 mRNA表达水平与淋巴结转移N分期的关系；D.HSDL2 mRNA表达水平与HPV感染的关系

2.2 HNSCC组织中HSDL2蛋白的表达应用HPA数据库分析HSDL2蛋白在HNSCC组织和正常组织中的表达，结果发现HSDL2蛋白主要定位于细胞质，少量表达于细胞核，在正常口腔组织中高表达(图2A)，在HNSCC组织中低表达(图2B)，提示HSDL2表达下调与HNSCC发生的高风险密切相关。免疫组化结果显示HSDL2蛋白表达及定位与HPA数据库检索结果一致，即HSDL2蛋白在正常组织中高表达，且主要表达于细胞质(图2C)，在HNSCC组织中低表达(图2D)。61例HNSCC组织中，HSDL2蛋白的阳性率(57.4%，35/61)和强阳性率(34.4%，21/61)均显著低于癌旁正常组织(阳性率90.9%，强阳性率81.8%)，且差异有显著性(P<0.05，表1)。

ABCD

表1 正常组织和头颈鳞状细胞癌组织中HSDL2蛋白的表达

2.3 HNSCC组织中HSDL2蛋白表达与临床病理特征的关系通过分析HSDL2蛋白表达与HNSCC临床病理特征的关系发现：HSDL2蛋白低表达与HNSCC患者性别、年龄及分化程度无关，与临床分期(P<0.01)和淋巴结转移(P<0.05)密切相关(表2，图3)。HSDL2蛋白在临床分期Ⅲ+Ⅳ期HNSCC组织中的强阳性率(5/33，15.2%)明显低于Ⅰ+Ⅱ期HNSCC组织(16/28，57.1%)(P=0.001)；HSDL2蛋白在有淋巴结转移HNSCC组织中的强阳性率(3/19，15.8%)明显低于无淋巴结转移HNSCC组织(18/42，42.9%)(P=0.047)；提示HSDL2蛋白可能参与HNSCC的发生、发展。

ABCD

表2 头颈鳞状细胞癌中HSDL2蛋白表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.4 HSDL2蛋白与HNSCC患者预后的关系应用HPA数据库分析HSDL2蛋白表达与HNSCC患者预后的关系，结果发现HSDL2蛋白低表达组患者(n=393)的生存期低于高表达组患者(n=106)，差异有统计学意义(P=0.014，图4)；提示HSDL2蛋白低表达HNSCC的患者预后不良。

图4 HSDL2表达与HNSCC患者生存期的关系

2.5 HSDL2参与的生物学进程及蛋白互作网络应用STRING数据库分析HSDL2参与的生物学进程及蛋白互作网络。GO富集分析结果显示，HSDL2主要参与调控脂肪酸分解代谢、脂肪酸氧化、靶向调控过氧化物酶体、蛋白质的转运等生物学进程(图5A)。蛋白网络分析的结果显示，与HSDL2互作的蛋白主要包括ACSF2、ALDH3A2等(图5B，表3)。

图5 STRING数据库分析HSDL2可能参与的生物学进程及互作蛋白：A.HSDL2可能参与的生物学进程(GO富集分析)；B.HSDL2互作蛋白网络图

表3 HSDL2 互作蛋白参与的生物学进程

3 讨论

HNSCC具有病情进展隐匿、早期临床症状不典型的特点，多数患者诊断时已发生淋巴结转移，致使HNSCC的发病率和病死率在全球范围内逐年升高[12-13]。由于HNSCC复杂的异质性，其机制尚未完全阐明；因此亟需进一步探索HNSCC中的分子标志物明确其可能的分子机制。

HSDL2最初鉴别于人胎脑组织的cDNA文库中，定位于染色体9q32位点，编码HSDL2蛋白[14]。该蛋白由418个氨基酸组成，包含N-端SDR结构域，C-端SCP-2结构域和过氧化物酶体靶向信号ARL[15]，对糖、类固醇和脂肪酸的能量代谢具有重要作用[16]。HSDL2作为类固醇脱氢酶家族成员之一，不仅与过氧化物酶体结合，而且还能够与辅酶NADPH相互作用形成复合体[15]，进而调控胆固醇代谢[17-18]。近年研究显示，HSDL2作为脂代谢中有效的调节因子在多种肿瘤中异常表达。Ruokun等[19]研究发现，HSDL2在人脑胶质瘤组织中异常高表达，且可正向调控胶质瘤细胞的增殖、周期阻滞和凋亡。Shi等[20]研究亦证实，下调HSDL2表达不仅可体外抑制肺腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，还可降低体内荷瘤的形成率及转移率。然而，HSDL2在HNSCC发生、发展中的作用尚未见报道。

本组通过UALCAN数据库分析发现，HSDL2 mRNA表达在HNSCC中显著降低，其低表达与临床分期、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。HPV作为HNSCC的预后标志物之一，可预示患者的转归。HPV阳性HNSCC患者具有更长的总生存期和无瘤生存期，且与治疗模式无关[21]。本组通过数据库分析亦发现，HSDL2在HPV阴性HNSCC组织中的表达水平低于正常组织和HPV阳性HNSCC组织(P<0.01)，因此HSDL2低表达提示HNSCC不良预后可能与HPV感染有关，但仍需深入分析。免疫组化染色结果显示，HSDL2蛋白在HNSCC组织中的表达显著低于正常癌旁组织(P<0.05)。该结果与HPA数据库一致，HSDL2蛋白在正常组织中呈中～高表达，在HNSCC组织中呈低表达。进一步分析发现，HSDL2蛋白表达与HNSCC临床分期(P=0.001)、淋巴结转移(P=0.047)呈负相关；提示HSDL2可能是作为抑癌基因在HNSCC的恶性演进中发挥作用，与Zhang等[22]在胆管癌中的研究结果相符。进一步通过HPA数据库对HSDL2蛋白表达与HNSCC患者预后的相关性进行分析，发现HSDL2蛋白低表达患者的生存期更低，提示HSDL2蛋白低表达可能是判断HNSCC不良预后的潜在分子标志物。

此外，通过STRING数据库分析发现，HSDL2参与调控蛋白转运和脂质代谢过程。这可能与HSDL2的特异性结构域有关。研究发现，HSDL2可通过C-端结构域中包含的PTS1特异性靶向过氧化物酶体，参与脂肪酸的过氧化物酶体的氧化过程[17]。同时，蛋白互作网络分析结果显示，HSDL2可与过氧化物酶体活化相关蛋白ECH1[23]、调节脂肪酸β-氧化过程的ALDH3A2[24]相互作用。上述结果说明，HSDL2调控蛋白转运和脂质代谢可能涉及多种生物学途径，其具体分子机制有待进一步分析。

近年多项研究证实HSDL2在肿瘤中扮演的角色具有“双重性”[5-8,22]，但HSDL2的所有研究仅局限在细胞表型和分子标志物，具体调控机制尚未见报道。因此，推测HSDL2的“双重性”可能与以下几个方面有关：(1)HSDL2在不同肿瘤细胞中的定位不同，导致其参与的生物学过程以及信号通路不同；(2)不同肿瘤的组织特异性也可导致HSDL2的差异表达；(3)不同肿瘤细胞的微环境也可导致HSDL2的基因双重性；(4)相关的致癌/抑癌基因也可影响HSDL2的生物学作用。总之，HSDL2的“双重性”取决于肿瘤细胞类型、微环境、相关基因等因素，是HSDL2未来研究的重点。

综上所述，HSDL2在HNSCC中的表达有不同程度的下调或缺失，其低表达提示肿瘤有较强的恶性程度和转移潜能，对HNSCC的早期诊断和预后评估具有一定的指导意义。