热休克蛋白在大鼠慢性吗啡镇痛耐受中的作用及机制

赵彦芬，赵峰，刘鹏森，毛轲

河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院麻醉科，郑州 450002

吗啡是临床上解除剧烈疼痛的主要药物，也是全球使用量最大的强效镇痛剂。然而，长期使用可能导致生理性吗啡耐受，主要表现为患者在注射吗啡后对疼痛的耐受减退甚至消失[1-2]。对于吗啡耐受的患者，若要达到同等的镇痛效果，需要更大剂量用药，但会引起一系列不良反应。越来越多的研究证实，小胶质细胞活化和炎性因子的产生在吗啡耐受形成过程中发挥重要作用[3-4]。因此，寻找能够安全有效地抑制小胶质细胞活化和炎性因子产生的潜在靶分子对于治疗吗啡耐受具有重要意义。热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一类高度保守且广泛表达的应激蛋白，在应激状态下表达显著增加，可保护机体免于受损[5-6]。已有研究证实，吗啡可以上调HSP60的表达[7]，但HSP60在吗啡耐受中介导小胶质细胞活化和炎症反应的作用尚不明确。本研究通过鞘内注射siRNA-HSP60和吗啡，观察siRNA-HSP60对大鼠疼痛耐受、炎性因子表达、TLR4-p38 MAPK信号通路的影响，旨在探索HSP60在吗啡耐受中的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 盐酸吗啡购自沈阳第一制药厂(批号：170406)；脂多糖(LPS)购自美国Sigma公司；Prime Script试剂盒购自日本TaKaRa公司；OX-42抗体购自美国Abcam公司；FITC标记的抗羊荧光二抗购自美国Millipore公司；HSP60、Toll样受体4(TLR4)、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。恒温水浴锅购自北京市长风仪器仪表公司；荧光显微镜购自日本Olympus公司；多功能酶标仪购自美国PerkinElmer公司。

1.2 实验动物及分组 雄性SD大鼠由河南省中医院动物中心提供，体重200～250 g。参照文献[8]的方法鞘内置管。麻醉大鼠后切开L4～L6背部皮肤，暴露L5～L6椎间隙，用8号针头倾斜插入。在L5椎间隙插入充满生理盐水的Microspinal导管。腹腔注射青霉素40万U以预防感染。大鼠鞘内置管后恢复3 d，鞘内注射2%利多卡因10 μl验证置管是否成功，如大鼠双后肢出现短暂瘫痪则为鞘内置管成功，否则为失败。采用随机数字表法将50只鞘内置管成功的大鼠分为对照组(n=10)、吗啡组(n=10)、siRNA-阴性对照(siRNA-NC)+吗啡组(n=10)、siRNA-HSP60+吗啡组(n=10)与LPS+siRNAHSP60+吗啡组(n=10)。对照组每天8:00注射生理盐水10 μl；吗啡组每天8:00鞘内注射15 μg吗啡(10 μl)；siRNA-NC+吗啡组和siRNA-HSP60+吗啡组分别给予含有10 μg siRNA-NC或siRNA-HSP60的DEPC溶液10 μl，然后注射15 μg吗啡(10 μl)；LPS+siRNA-HSP60+吗啡组在注射吗啡前30 min给予10 μg siRNA-HSP60(10 μl)和10 μl LPS溶液，不同药物间隔30 min，然后注射15 μg吗啡(10 μl)。各组均连续处理7 d。

1.3 大鼠行为学测试 采用水浴甩尾法(hot-water tail flick test)测定大鼠甩尾潜伏期(tail flick latency，TFL)的变化，以评价吗啡的镇痛效果。各组分别在1、3、5和7 d给予吗啡后30 min将鼠尾1.5～3.0 cm放入(52±0.5) ℃恒温水浴中，用秒表记录鼠尾自浸入水中到出现甩尾动作的时间，此时间间隔为甩尾反应的TFL，为防大鼠组织发生损伤，如大鼠在10 s内未出现甩尾，则TFL记为10 s。TFL用最大效应百分数(MPE)表示：MPE(%)=(给药后TFL－给药前TFL)/(10－给药前TFL)×100%。

1.4 脊髓组织制备及OX-42免疫荧光化学染色 给药7 d后每组随机抽取6只大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(60 mg/kg)深度麻醉并处死，左心室灌注预冷的生理盐水100 ml和4%多聚甲醛400 ml固定。取L4～L6节段脊髓，4%多聚甲醛固定、乙醇梯度脱水、二甲苯透明，石蜡浸润包埋、切片，厚度5 μm，置于0.01 mol/L PBS溶液中。每只大鼠脊髓分别取5个连续切片备用。根据OX-42试剂盒说明书步骤进行免疫荧光染色。OX-42(1:300) 4 ℃孵育过夜，荧光素标记羊抗小鼠二抗(1:1000) 37 ℃避光孵育1 h，各步骤间用PBS洗涤3次，最后用50%甘油封片。采用Olympus数字显微镜系统(400倍镜)观察，随机选取每张组织切片的3个视野进行数码拍照，应用Image pro-Plus 6.0软件对OX-42阳性细胞进行计数分析。

1.5 RT-PCR法检测脊髓组织中HSP60以及炎性因子IL-1β、TNF-α mRNA的表达 给药7 d后各组其余4只大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(60 mg/kg)深度麻醉并处死，分离L4～L6节段脊髓组织，-80 ℃保存。提取总RNA，应用Prime Script试剂盒的SYBR Green Assay完成反转录反应。采用cDNA的第一链作为模板进行PCR扩增。使用ABI7500快速实时定量PCR系统，以GAPDH为内参，采用 2-ΔΔCt法分析待测基因的相对表达水平。目的基因引物序列由金斯瑞公司合成，具体如下：HSP60，上游5'-TTGATGTATGCTCTGTGGAAG-3'，下游5'-AGGCCTACGTATGAATGCGTATTGG-3'； IL-1β，上游5'-TCATTGTGGCTGTGGAGAAG-3'，下游5'-AGGCCACAGGTATTGTCG-3'；TNF-α，上游5'-CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3'，下游5'-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3'；GAPDH，上游5'-AACGACCCCTTCATAC-3'，下游5'-TCCACGACATACTCAGCC-3'。

1.6 Western blotting检测脊髓组织中HSP60、TLR4、p-p38MAPK和p38MAPK蛋白的表达水平 取剩余脊髓组织，按照KeyGEN全蛋白提取试剂盒步骤提取总蛋白，使用BCA定量试剂盒进行定量分析。上样量25 μg/孔，10% SDS-PAGE电泳分离蛋白后转移至PVDF膜上，以含5% BSA的TBST液室温封闭1 h，加入一抗HSP60(1:1000)、TLR4(1:1000)、p-p38M APK(1:1000)、p38M APK(1:1000)、β-actin(1:5000)孵育过夜，TBST洗膜3次，室温条件下以辣根过氧化物酶标记特异性二抗(1:5000)孵育1 h，采用ECL化学发光液于荧光和可见光凝胶成像系统(Alpha Innotech)显影并进行灰度分析，计算目的蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值，半定量分析目的蛋白的表达水平。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，进一步两两比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠吗啡耐受形成中伴随着脊髓组织HSP60的异常表达 RT-PCR和Western blotting检测结果显示，与对照组比较，吗啡组大鼠脊髓组织中HSP60 mRNA和蛋白的表达量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。为了进一步研究HSP60参与吗啡耐受形成的机制，连续7d鞘内注射siRNA-HSP60，结果显示，与siRNA-NC+吗啡组比较，siRNA-HSP60+吗啡组大鼠脊髓组织中HSP60 mRNA和蛋白的表达量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

图1 各组大鼠脊髓组织中HSP60 mRNA和蛋白的表达量比较(n=4)Fig.1 Comparison of the levels of HSP60 mRNA and protein in spinal cord tissues of rats in each group (n=4)

2.2 抑制HSP60可明显改善大鼠吗啡镇痛耐受的形成 行为学测试结果显示，注射吗啡1、3、5和7 d后，与对照组相比，吗啡组大鼠对疼痛的耐受度增加(P<0.05)；与注射吗啡1、3 d后相比，吗啡组大鼠在注射吗啡5 d和7 d后疼痛耐受明显减弱(P<0.05)，表明形成了吗啡耐受。注射吗啡5 d和7 d后，siRNA-HSP60+吗啡组大鼠较siRNA-NC+吗啡组大鼠对疼痛的耐受度明显增强，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

2.3 HSP60缺失抑制大鼠腰段脊髓背角小胶质细胞的活化 免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，吗啡组大鼠脊髓组织中OX-42阳性细胞数明显增多(P<0.05)；与siRNA-NC+吗啡组相比，siRNAHSP60+吗啡组大鼠脊髓组织中OX-42阳性细胞数明显减少，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。

图2 HSP60在大鼠吗啡镇痛耐受形成中的作用(n=10)Fig.2 Inhibition of HSP60 significantly improves the formation of morphine antinociceptive tolerance (n=10)

2.4 鞘内注射siRNA-HSP60抑制吗啡耐受大鼠脊髓组织中炎性因子IL-1β和TNF-α的释放 RT-PCR检测结果显示，与对照组相比，吗啡组大鼠脊髓组织中IL-1β、TNF-α mRNA的表达量均明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；而siRNA-HSP60+吗啡组大鼠脊髓组织中IL-1β、TNF-α mRNA的表达量均明显少于siRNA-NC+吗啡组，差异有统计学意义(P<0.05，图4)。

2.5 下调H S P 6 0 通过抑制吗啡耐受大鼠脊髓TLR4-p38 MAPK信号通路缓解大鼠吗啡耐受 Western blotting检测结果显示，与对照组相比，吗啡组大鼠脊髓中TLR4和p-p38MAPK的表达水平明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与siRNANC+吗啡组相比，siRNA-HSP60+吗啡组大鼠脊髓中TLR4和p-p38MAPK的表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，图5)。表明下调HSP60可抑制TLR4-p38MAPK信号通路激活。

图3 各组大鼠脊髓组织中OX-42阳性细胞数比较(n=6)Fig.3 Comparison of the number of positive OX-42 cells in the spinal cord of rats in each group (n=6)

图4 各组大鼠脊髓组织中IL-1β、TNF-α mRNA的表达水平(n=4)Fig.4 Expression levels of IL-1β and TNF-α mRNA in spinal cord tissues of rats in each group (n=4)

2.6 激活TLR4-p38MAPK信号通路可拮抗HSP60缺失对吗啡耐受的抑制作用 Western blotting检测结果显示，与siRNA-HSP60+吗啡组相比，LPS+siRNA-HSP60+吗啡组大鼠脊髓组织中TLR4和p-p38MAPK的表达水平明显增高，差异有统计学意义(P<0.05，图5)；同时，行为学测试结果显示，在5 d和7 d形成吗啡耐受时，LPS+siRNA-HSP60+吗啡组大鼠对疼痛的耐受度弱于siRNA-HSP60+吗啡组，差异有统计学意义(P<0.05，图6)。

3 讨 论

应激状态下HSP往往表现为过度表达或异位表达，并且参与信号转导的过程。其中HSP60参与多种临床病理过程，如自身免疫性疾病、心肌炎、动脉粥样硬化，以及移植排斥反应等免疫相关的疾病[9-10]。本研究采用连续鞘内注射吗啡建立吗啡镇痛耐受模型，Western blotting检测结果证实吗啡组HSP60表达量明显增加，沉默HSP60可显著改善吗啡耐受。

图5 各组大鼠脊髓组织中TLR4-p38MAPK相关蛋白的表达情况(n=4)Fig.5 Expression of TLR4-p38MAPK related proteins in spinal cord tissue of rats in each group (n=4)

图6 激活TLR4-p38MAPK信号通路逆转HSP60缺失对吗啡耐受的作用(n=10)Fig.6 Activation of TLR4-p38MAPK signaling pathway reverses the effect of HSP60 deficiency on morphine tolerance (n=10)

小胶质细胞在吗啡耐受中发挥重要作用，许多研究证实，吗啡处理可促进OX-42的表达，并诱导胶质源性促炎细胞因子的释放[11]。白藜芦醇可通过抑制小胶质细胞的活化及炎性因子的产生，降低吗啡耐受性[12]。文献报道，HSP60缺失会减轻小胶质细胞的炎症反应[13]。OX-42是小胶质细胞的特异性标志物，本研究结果显示，吗啡组大鼠OX-42阳性细胞数较对照组明显增多，表明大鼠经吗啡处理后，小胶质细胞显著活化。沉默HSP60后OX-42阳性细胞数减少，表明抑制HSP60阻碍了吗啡介导的小胶质细胞活化。部分研究表明，在吗啡注射模型或其他神经性疼痛模型中，促炎因子IL-1β和TNF-α的表达水平显著升高[14]；抑制炎性因子的产生能改善吗啡耐受[3,15]。本研究结果显示，沉默HSP60可抑制吗啡介导的IL-1β和TNF-α表达，表明HSP60缺失可显著抑制吗啡介导的小胶质细胞活化及炎症反应。

吗啡能够与机体TLR4上的髓样分化因子2 (myeloid differentiation factor-2，MD-2)相结合，激活TLR4信号通路，活化小胶质细胞，释放炎性因子(包括TNF-α和IL-1β)，从而加重中枢敏化，降低机体对疼痛的耐受度[16-17]。有研究结果显示，抑制TLR4可降低吗啡耐受性[17]。若能找到一个分子或者药物阻断TLR4通路，有可能抑制吗啡介导的小胶质细胞活化及炎症反应，最终调控机体对疼痛的耐受。Swaroop等[18]研究发现，沉默HSP60可通过抑制TLR4-p38MAPK通路降低小胶质细胞中TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和IL-6的表达。本研究发现，沉默HSP60可显著抑制TLR4-p38MAPK信号通路的激活。为了进一步证实沉默HSP60是通过调控TLR4-p38MAPK信号通路而影响吗啡耐受，本研究采用LPS激活TLR4信号通路，结果发现，激活TLR4信号通路后，沉默HSP60对吗啡耐受的作用被逆转，证实TLR4-p38MAPK信号通路参与了HSP60调控吗啡耐受的形成过程，提示激活TLR4受体能够明显逆转脊髓HSP60缺失对大鼠吗啡耐受的改善作用。

综上所述，沉默HSP60可通过抑制小胶质细胞活化和炎性因子的释放而降低吗啡耐受性，TLR4-p38MAPK信号通路参与了该过程，为HSP60应用于吗啡耐受的临床防治提供了理论基础。