2 株鸡源血清4 型禽腺病毒的分离鉴定及致病性研究

祝常椿，钱 焱，满成连，刘 源，杜银平，秦 涛，陈素娟，彭大新

（扬州大学兽医学院/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009）

心包积水-肝炎综合征是由禽腺病毒（Fowl ade⁃novirus，FAdV）引起的一种传染病，FAdV 可以感染鸡、鸭[1]、鹅等多种家禽，既可水平传播，又可垂直传播。该病特征性剖检变化主要表现为心包积液，肝脏肿大出血伴有坏死灶[2]，组织学研究表明病鸡的肝细胞出现脂肪变性和坏死，肝细胞内可见特征性的核内包涵体[3]。该病最早于巴基斯坦的安卡拉地区爆发和流行，因此又称安卡拉病、心包积水综合征（HPS）[4]。随后在北美洲、墨西哥、印度和韩国等地爆发和流行[5]。2014 年之前，HPS 在我国散发，2015 年开始在我国山东地区流行，逐渐蔓延至山西、湖北、黑龙江和江苏等地，目前呈全国性流行趋势，给养禽业造成了严重的损失。该病多发于3 周龄～5 周龄的肉鸡，死亡率在30%～70%，最高可达80%。随着鸡日龄的增大，该病的死亡率也随着降低。

五邻体蛋白（Penton）、六邻体蛋白（Hexon）和纤维蛋白（Fiber），共同构成FAdV 的衣壳。Hexon 蛋白是禽I 群腺病毒的主要结构蛋白，携带主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，Hexon 基因高度保守，能够准确区分FAdV 的类型。每个五邻体基底上伸出一条或两条纤突即Fiber蛋白，与FAdV 的毒力和抗原性相关。Hexon 和Fi⁃ber2 基因编码的氨基酸差异会影响FAdV 的致病性[6]。本研究对采集自江苏养鸡场疑似感染FAdV 的病鸡病料样品进行病原的分离与鉴定，对病毒株的致病性进行初步分析，为进一步探究FAdV 的致病性差异和毒力演变提供了基础数据。

1 材料与方法

1.1 样品来源及主要实验材料病死鸡来源于江苏东台13 个不同养鸡场，病鸡精神沉郁，排黄绿色稀粪，对病死鸡剖检可见肝脏肿胀、出血、心包内有胶冻样积液，肺脏水肿、瘀血，肾脏肿大出血。采集病死鸡的心脏、肝脏和脾脏等病变组织样品，-70 ℃保存备用。

鸡肝癌细胞（LMH）由本实验室保存；SPF 鸡胚购自浙江立华农业科技有限公司，由本实验室孵育，饲养至4 周龄。Mix 购自Vazyme 公司；DNA 凝胶回收试剂盒购自Axygen 公司；Alu I 限制性内切酶购自NEB 公司；培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）购自Gibco 公司；

1.2 引物的设计与合成参考GenBank中登录的血清4型FAdV（FAdV-4）代表株HB1510株（KU587519.1）的Hexon 和Fiber2 全基因序列，应用Premier 5.0 设计Hexon 基因和Fiber2 全基因的引物：Hexon-F：5'-ATGGCGGCCCTCACGCCCGA-3'/Hexon-R：5'-GCGTT GCCTGTGGCGAAA-3'（2 814 bp），Fiber2-F：5'-CG GATATCAATATGCTCCGGGCCCCTAA-3'/Fiber2-R：5'-AGAATGCGGCCGCTATTTTACGGGAGGGAGGCCG-3'（1 440 bp）。鉴定引物参照王颖[7]等的引物，F：5'-AATTTCGACCCCATGACGCGCCAGG-3'/R： 5'-TGGC GAAAGGCGTACGGAAGTAAGC-3'（500 bp）。引物合成和测序由南京擎科新业技术有限公司完成。

1.3 病料样品的PCR 检测将采集的13 份病料组织无菌剪碎置于5 mL的研磨管，分别与病毒保存液以1∶4 的比例混合；用生物样品匀质仪以6 500 r/min 的速度匀浆、研磨；将研磨管放置于-70 ℃及37 ℃水浴反复冻融3 次后以8 000 r/min 离心10 min，分别取上清500 μL，采用蛋白酶K/氯仿抽提法提取样品DNA，然后用核酸蛋白检测仪测定DNA 浓度和纯度后-80 ℃保存备用。以提取的DNA 为模板，使用鉴定引物对样品分别进行PCR 鉴定。

1.4 病毒的分离培养与鉴定参照文献方法[7]，将上述经PCR 鉴定为阳性的病料样品上清液100 μL 接种到LMH 细胞，每天观察细胞状态，待其出现明显的病变后收集病毒液。待病毒液形成稳定的细胞病变后继续传5 代，使用1.2 合成的鉴定引物对收集的病毒液进行PCR 鉴定并对得到的病毒液进行TCID50的测定。

1.5 分离病毒的Hexon基因和Fiber2基因扩增及序列分析提取1.4 中鉴定为FAdV 阳性细胞上清液的DNA 为模板，分别采用引物Hexon-F/R 和Fiber2-F/R PCR 扩增FAdV Hexon 和Fiber2 基因。PCR 反应程序：95 ℃5 min；95 ℃45 s、57 ℃45 s、72 ℃2 min，35个循环；72 ℃10 min。PCR产物由南京金斯瑞生物科技有限公司测序，并利用MegAlign 和MEGA7.0 软件对Hexon 基因进行核苷酸同源性及遗传进化分析，同时对Fiber2 基因进行Alu 酶谱分析。

1.6 SPF 鸡的回归试验将30 只4 周龄的SPF 鸡随机分成3 组，每组10 只。其中两组分别接种鉴定为FAdV-4 的2 株病毒，每只鸡注射0.1 mL 含有106TCID50的病毒液；第3 组以相同途径和剂量接种无菌PBS 作为阴性对照。在相同条件下隔离饲养，接种后每12 h 观察一次，连续观察14 d，统计鸡的发病和死亡情况。解剖病死鸡，观察剖检病理变化，同时采集病死鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑组织，用4%甲醛溶液固定，48 h 后，制作切片观察组织病变情况，同时将采集的组织按照1.4方法进行分离培养与鉴定。

2 结果与讨论

2.1 病料样品的PCR 鉴定结果以Hexon 基因鉴定引物对13 份病料样品提取的DNA 进行PCR 扩增，结果显示9 份在约500 bp 处出现目的条带，与预期大小一致（图略），初步判断这9 份病料样品为FAdV-4 阳性。

2.2 病毒的分离与鉴定结果将9 份阳性病料样品研磨液接种单层的LMH 细胞，2 份出现了典型的细胞病变，细胞皱缩，逐渐变圆，折光性增强，细胞间距增大，突触消失有的多个细胞聚集在一起，随后成簇或成葡萄串状。样品1 在接种细胞60 h 后产生病变，样品2 在接种细胞48 h 后产生病变。病毒连续稳定传代，将第5 代细胞上清液用鉴定引物进行PCR 鉴定为FAdV-4 核酸阳性。两个样品分别命名为DT 和AN。2 株病毒分别接种LMH 细胞，收获病毒，按照Reed-Muench 法计算得出DT 和AN 的效价分别为106.12TCID50/0.1 mL和106.78TCID50/0.1 mL。

2.3 分离病毒的Hexon基因和Fiber2基因PCR 扩增及序列分析提取DT 和AN 株病毒的DNA，分别使用Hexon-F/R 引物和Fiber2-F/R 引物扩增Hexon 基因和Fiber2基因，结果显示，2株病毒在约2 800 bp处均出现Hexon 基因目的条带（图1A），在约1 400 bp 处均出现Fiber2 基因目的条带（图1B），条带与预期大小一致。

图1 Hexon 和Fiber2 基因全长的PCR 扩增Fig. 1 PCR amplification of the full-length Hexon and Fiber2 genes

序列测定显示两株分离株的Hexon 基因全长为2 814 bp，编码937 个氨基酸。通过MegAlign 软件比对显示，两株分离株Hexon 核苷酸的同源性为99.9%，与I 群FAdV-4 核苷酸同源性为98.6%～100%，其中DT 和AN 株与中国病毒株（SDNY1-15、PDS株）的亲缘关系最近。Hexon 核苷酸同源性分别为99.9%和100%。与印度分离株（PK-01）Hexon 核苷酸同源性为99.8%，与韩国（Kr-Changnyeong）和俄罗斯（Krasnodar）分离株Hexon 核苷酸同源性为98.6%～99.1%。遗传进化显示，分离株与FAdV-4 亲缘关系最为接近，属于同一个分支，与其他血清型相对较远，进一步确定DT 和AN 株为I 群基因C 型FAdV-4（图2）。基于Hexon 基因编码的氨基酸遗传进化分析显示，DT 株与其他病毒株氨基酸同源性为98.3%～99.9%，AN 株与其他病毒株氨基酸同源性为98.4%～100%。两株分离病毒与印度分离株的氨基酸同源性最高，与韩国病毒株相比，两株病毒第189 位氨基酸由Ⅰ突变成R，与韩国、俄罗斯病毒株相比两株病毒第196 位氨基酸由E 突变成Q。

Masaji 等对Fiber2 基因进行Alu 酶切分析，可以区分致病性FAdV-4 和非致病性FAdV-4[8]。Fiber2基因全长1 400 bp，编码479 个氨基酸。用Alu 酶谱分析可将两株分离株Fiber2 基因切成1 202 bp、142 bp、102 bp 和51 bp 大小的片段，与致病性病毒株一致。基于该基因编码的氨基酸分析显示，两株分离株在aa11～aa16 位均为ENGKPE，与国内致病性病毒HB1510 株（KU587519.1）相同，与非致病性病毒株ON1（GU188428.1）、KR5（HE608152.1）相比有不同程度的插入和突变。与致病性和非致病性的突变位点相比，分离株Fiber2 基因编码的氨基酸位点具有致病性病毒株的特点，但与HB1510 株相比，AN 株也在179 位由I 突变为T，DT 株在209 位由N突变为S、385 位由M 突变为I。这些突变位点是否与两株分离病毒的毒力差异有关需进一步研究。

图2 Hexon 基因系统发育进化树Fig. 2 Phylogenetic tree of Hexon genes

2.4 动物回归试验结果接种DT 和AN 株病毒组的SPF 鸡在经肌肉注射后第2 d 开始出现食欲不振，精神萎靡，被毛杂乱，扎堆等异常症状，随后在第4 d两组SPF 鸡分别开始出现了死亡。解剖病死鸡，两组鸡心脏均出现心包积液，AN 组病死鸡较DT 组病死鸡严重一些；两组肝脏均有肿大出血，颜色变黄褐色；肺部有少量的瘀血；脾脏肿大出血；肾脏肿大出血，脑组织树枝状充血。7 d 之后感染组鸡均没有再出现死亡。DT 组的死亡率为50%，AN 组死亡率为90%，阴性对照组的SPF 鸡表现正常。将病料样品研磨液接种单层的LMH 细胞，可以出现与2.2 相同的典型细胞病变，用鉴定引物对提取的细胞样品DNA 进行PCR 鉴定，结果在约500 bp 处出现目的条带，与预期大小一致（图略）。

病理组织学结果显示，AN 组较DT 组鸡心脏内出现少量中性粒细胞浸润。两组均可见肝脏局灶性坏死，肝细胞脂肪变性，核内可见数量较多的嗜碱性包涵体；脾脏内毛细血管怒张，充血，脾窦内巨噬细胞数量增多；肺脏间质内巨噬细胞及少量异嗜性粒细胞浸润；肾脏皮质部肾小管之间有数量不等的淋巴细胞和少量异嗜性粒细胞浸润，甚至个别肾小管上皮坏死，管腔内可见蛋白尿管型。脑未见明显病变（图3）。

图3 FAdV-4 感染鸡的组织病理学变化Fig. 3 Histopathologic changes of FAdV-4 infected chickens

Sun 等通过肌肉注射和口服两种方式，将禽腺病毒感染10 日龄和20 日龄的SPF 鸡，解剖结果均出现典型的心包积液和肝炎[9]。本研究动物实验表明分离株均能致死4 周龄SPF 鸡，死亡鸡剖检病变主要集中在肝脏和心脏，尤其是感染后的第5 d 病变最严重。心包积液是主要的病变之一，可能是急性炎症反应导致[10]。根据病理变化并结合文献资料报道[11]，进一步证明引起SPF 鸡死亡的病原是FAdV-4。病理组织学变化为肝细胞核内可见嗜碱性包涵体，含有包涵体的肝细胞核明显大于正常肝细胞核，肺脏间质内存在巨噬细胞及少量异嗜性粒细胞浸润，与Bouquet 的研究结果一致[12]。除了肝脏、心脏有典型的病变之外，在脾脏、肾脏和肺脏也有不同程度的病变，这可能和病毒可在不同器官的淋巴组织中分布有关[13]。

本实验分离鉴定出两株I 群FAdV-4，发现了两株病毒株致病力存在一定差异，为进一步探究FAdV 毒力演变以及致病机理奠定了基础。