副溶血弧菌外膜蛋白A（VP0764）的分析表达及其免疫保护效果初步评价

张 欣，韩先干，王亚磊，张海洋，王 权，祁克宗，蒋 蔚*，宋祥军

（1.安徽农业大学兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室，安徽 合肥 230036；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）为革兰氏阴性菌，中度嗜盐性，菌体在显微镜观察下呈现出杆状结构，兼性厌氧，可感染鱼虾蟹等，是引起人类疾病的食源性致病菌[1-2]。革兰氏阴性菌的外膜（Out⁃er membrane，OM）主要由磷脂双分子层、膜蛋白和脂多糖等物质组成，其特有的细胞壁结构[3]，可作为抵制外界环境的屏障。外膜蛋白（Outer membrane proteins，OMP）作为革兰氏阴性菌外膜的重要成分，具有多种功能。研究表明，OMP 与弧菌的黏附作用密切相关，可介导细菌侵入细胞，OMP 与细菌生物被膜形成有关；此外，研究表明OMP 作为亚单位疫苗的候选靶分子，具有良好的免疫保护性，能够有效激发宿主的体液免疫和细胞免疫反应，副作用小[4-5]。副溶血弧菌致病机制的研究中涉及到多种实验动物感染方式，包括小鼠口服感染和腹腔冲击感染[6-7]，本研究团队前期也通过小鼠腹腔冲击感染的方式来评价副溶血弧菌重要抗原的免疫效果[8-9]。

副溶血弧菌编码4 种OmpA，已有研究表明部分OmpA 蛋白在免疫原性和疫苗开发方面具有很大的潜力[10-11]。目前对副溶血弧菌的OMP 的表达纯化、抗体制备及免疫学检测方法的研究还比较少见，本研究克隆了副溶血弧菌ompA（VP0764）基因，并重组表达该蛋白，进一步制备鼠源多克隆抗体，同时利用His-OmpA（VP0764）免疫动物，研究该蛋白是否具有免疫保护性，以期为研究副溶血弧菌的基因工程疫苗和建立该菌的快速检测方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 病原菌、质粒和实验动物霍乱弧菌（CICC23794）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；创伤弧菌（ATCC27562）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）和大肠杆菌O157∶H（ATCC35150）均购自美国模式培养物集存库；副溶血弧菌SH112 株（血清型为O3∶K6），表达载体pET-28a（+）均由本实验室保存；大肠杆菌DH5α 和BL21 感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司；pMD19-T Simple 载体购自TaKaRa 公司。8 周龄雌性ICR 小鼠购自上海杰思捷实验动物有限公司。

1.2 主要试剂质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；异丙醇硫代-β-D 半乳糖苷（IPTG）、T4 连接酶、限制性核酸内切酶、蛋白质Marker 均购自宝生物工程（大连）有限公司；弗氏佐剂购自Sigma 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术（上海）有限公司；山羊抗鼠IgG-HRP 购自Abcam 公司；His Bind 树脂纯化试剂盒购自MERCK 公司。

1.3OmpA（VP0764）编码蛋白质的生物信息学分析根据GenBank 中登录的副溶血弧菌RIMD 2210633 株VP0764 基因型（BA000031.2）序列，采用Primer premier 5.0 软件设计扩增副溶血弧菌SH112株的ompA（VP0764）基因引物序列（表1）。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司Invitrogen 有限公司合成。

表1 引物信息与PCR 扩增目的片段大小Table 1 The primer sequences and the sizes of PCR amplicons

以提取的SH112 株全菌基因组为模板，以VP0764-ORF-F/VP0764-ORF-R 为上下游引物，扩增ompA（VP0764）整个编码区基因序列，并将纯化后的产物连接至pMD19-T Simple 载体后测序，采用MEGA-X 软件对ompA（VP0764）核苷酸序列进行遗传进化分析，并采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建进化树，比较SH112 株ompA（VP0764）与GenBank登录的14 株不同来源的副溶血弧菌参考菌株的同源性。 通 过Signal.p（http://www.cbs.dtu.dk/services/Sig⁃nalP/）和TMHMMv.2.0（http://www/cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对副溶血弧菌ompA（VP0764）基因编码的氨基酸序列进行信号肽和跨膜结构预测，通过（http://www.bio-soft.net/sms/prot_mw.html）预测副溶血弧菌ompA（VP0764）蛋白质分子质量，利用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）程序，预测该蛋白质的理论分子质量、理论等电点，利用SWISS（https://swissmodel.expasy.org）在线软件预测该蛋白质的三级结构，通过http://imed.med.ucm.es/Tools/antigen⁃ic.pl预测该蛋白的抗原决定簇。

1.4 重组表达质粒的构建及His-OmpA（VP0764）重组蛋白的表达以SH112 株全菌基因组为模板，以VP0764-OmpA-F/VP0764-OmpA-R 为上下游引物，根据1.3 分析结果扩增去除信号肽编码区的om⁃pA（VP0764）基因序列。回收、纯化后的PCR 产物与pET-28a（+）经BamH I/Sac I 酶切处理后连接，构建的重组质粒pET28a-ompA，经PCR 鉴定后将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，以终浓度1 mmol/L 的IPTG 诱导表达His-OmpA（VP0764）重组蛋白，SDS-PAGE 检测重组蛋白的表达，使用His Bind 树脂纯化试剂盒对表达产物进行纯化，利用BCA 蛋白试剂盒测定蛋白浓度，-20 ℃保存备用。

1.5 His-OmpA（VP0764）重组蛋白抗血清的制备和鉴定将纯化的His-OmpA（VP0764）重组蛋白与等量完全弗氏佐剂乳化后，采用足垫多点免疫进行首次免疫，共免疫4 只小鼠（0.1 mg/只）。两周后以等剂量弗氏不完全佐剂与His-OmpA（VP0764）重组蛋白乳化，采用背部皮下多点注射二免，二免后间隔2 周再以等量弗氏不完全佐剂与His-OmpA（VP0764）重组蛋白乳化后腿部肌肉注射，进行三免，3 次免疫剂量相同。三免一周后眼球采血制备血清，用纯化的His-OmpA（VP0764）重组蛋白作为包被抗原（0.4 μg/mL，用5%胎牛血清经PBST 稀释，每孔100 μL），以His-OmpA（VP0764）重组蛋白的小鼠多克隆抗血清（1∶1 000）为一抗，以山羊抗鼠IgG-HRP（1∶20 000）为二抗，利用间接ELISA 方法测定其效价[12]，设健康小鼠血清作为阴性对照。将副溶血弧菌培养至对数生长期，超声破碎后收集细菌全菌蛋白，以鼠抗His-OmpA（VP0764）的免疫血清（1∶500）为一抗，以山羊抗鼠IgG-HRP（1∶4 000）为二抗，利用ECL 发光显色，western blot 检测纯化的重组蛋白和副溶血弧菌的全菌蛋白的反应性，设BSA 为阴性对照。同时超声破碎后按常规方法提取霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌和大肠杆菌的全菌蛋白，同上进行western blot 检测。

1.6 His-OmpA（VP0764）重组蛋白对小鼠免疫保护效果的研究将45 只8 周龄ICR 小鼠随机分成3个小组：SH112 全菌组、OmpA 重组蛋白组、PBS 对照组，每组15只。首免SH112全菌组小鼠免疫甲醛灭活的SH112 全菌疫苗（200 μL/只），OmpA 重组蛋白组小鼠以0.1 mg/只免疫His-OmpA（VP0764）纯化蛋白（200 μL/只），对照组小鼠等体积注射PBS（200 μL/只），前两组首免分别为添加等量弗氏完全佐剂乳化的灭活SH112 全菌和His-OmpA（VP0764）纯化蛋白。首免后14 d 和28 d 以同样的方式对前两组分别加强免疫等量弗氏不完全佐剂乳化的相应免疫物。三免7 d 后小鼠尾尖采血，以灭活的SH112 全菌为包被抗原（每孔约1×107cfu），利用间接ELISA 方法[12]测定各组小鼠血清抗体水平。三免10 d后对各组实验鼠腹腔注射副溶血弧菌全菌（2×107cfu/只，200 μL），24 h内记录小鼠死亡情况，分析各组保护率。

2 结 果

2.1 基因ompA（VP0764）编码蛋白质的生物信息学分析以副溶血弧菌SH112 株基因组为模板，以VP0764-ORF-F/VP0764-ORF-R 为上下游引物，PCR扩增ompA（VP0764）整个编码区基因序列，测序结果显示，SH112 株ompA（VP0764）全长990 bp，编码330 个氨基酸，测序结果上传NCBI 数据库，获得登录号MN602042。与NCBI 登录的14 株副溶血弧菌OmpA 的氨基酸序列相似性为100%，核苷酸序列相似99.0%～100%，系统进化树显示各菌株有较近的亲缘关系（图1）。使用Signal P 4.0 在线软件对OmpA蛋白进行信号肽的预测，结果显示：aa1～aa20 为该蛋白的信号肽序列，序列为MKKLAAVISASLLMA⁃SAAQA。通过Psortb 3.0 在线预测结果显示：该蛋白在OMP 中的占比为99.3%，而在细胞质、胞质膜等占比均为0，预测结果表明该蛋白确实是一种OMP。

图1 副溶血弧菌ompA 基因序列系统进化树Fig. 1 The phylogenetic tree of V. parahaemolyticusompA gene sequences

ProtParam 在线网站预测结果显示ompA（VP0764）编码的成熟外膜蛋白理论分子量约为34.08 ku，推测理论等电点为4.25，分子式为C1498H2341N397O498S6，原子总数为4 740，脂肪指数为81.29；亲水性的平均值（GRAVY）为-0.203；不稳定指数为26.82，显示该蛋白为稳定蛋白。采用SOPMA 和SWISS 预测该蛋白的二级结构和三级结构。结果显示，该蛋白的二级结构序列中无规则卷曲所占比例为44.83%，α-螺旋为32.92%，β-转角为6.27%，β-片层为15.99%，三级结构显示该蛋白是由β-桶结构组成的保守结构域，具有孔蛋白的结构（图2）。

图2 副溶血弧菌OmpA（VP0764）蛋白三级结构预测Fig. 2 Tertiary structure prediction of V. parahaemolyticus OmpA(VP0764) protein

OmpA（VP0764）蛋白抗原决定簇的预测结果显示，该蛋白的平均抗原倾向指数为1.0 284，抗原指数较高，同时该蛋白经预测有11 个抗原决定簇区域，分 别 位 于aa4～aa24、aa33～aa41、aa49～aa56、aa79～aa112、aa118～aa129、aa159～aa165、aa171～aa197、aa224～aa234、aa236～aa245、aa250～aa256、aa263～aa273 及aa305～aa315，该蛋白具有较多优势抗原表位结构表明该蛋白是潜在的具有免疫原性的蛋白。

2.2 重组表达载体的鉴定PCR 扩增获得去除信号肽序列的副溶血弧菌SH112 株的ompA（VP0764）基因，大小约为900 bp。对pET28a-ompA 重组质粒双酶切鉴定，结果显示得到2 条大小分别约900 bp 和5 900 bp 的基因片段，与预期结果相符（图3），表明正确构建重组表达质粒pET28a-ompA。

图3 重组载体pET28a-ompA 的鉴定Fig. 3 Identification of recombinant plasmid pET28a-ompA

2.3 His-OmpA（VP0764）重组蛋白的表达及纯化重组表达质粒pET28a-ompA 转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG 的诱导后，SDS-PAGE 检测结果显示，在低温低转速的诱导条件下，以可溶性方式表达分子量约为39 ku（包含pET-28a（+）质粒编码的标签蛋白）的His-OmpA（VP0764）。经His-Bind 树脂纯化后，经过透析和浓缩，可获得浓度为2.3 mg/mL 的His-OmpA（VP0764）纯化蛋白（图4）。

图4 His-OmpA（VP0764）重组蛋白的SDS-PAGE 检测Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the recombinant His-OmpA(VP0764) protein

2.4 重组蛋白His-OmpA（VP0764）多抗高免免疫血清的检测His-OmpA（VP0764）重组蛋白免疫小鼠三免后收集小鼠血清，间接ELISA 测定小鼠血清效价，结果显示免疫血清的效价在1∶32 000 以上，表明纯化的该重组蛋白能够诱导机体产生良好的免疫反应。将重组蛋白和副溶血弧菌全菌蛋白分别经SDS-PAGE 后转移至PVDF 膜上进行western blot 检测，结果显示在重组蛋白（39 ku）和副溶血弧菌全菌蛋白（33.8 ku）泳道均出现特异性条带，而阴性对照无反应（图5）；同时western blot 结果进一步显示该重组蛋白的免疫血清与其他细菌的全菌蛋白均不发生特异性反应（图6）。以上结果表明所表达的该重组蛋白具有良好的免疫原性，能刺激机体产生特异性抗体，该免疫血清可以有效识别目的菌的天然蛋白。

图5 His-OmpA（VP0764）蛋白的western blot 分析Fig. 5 Western blot analysis of His-OmpA(VP0764) protein

2.5 His-OmpA（VP0764）重组免疫效果评价将重组蛋白His-OmpA（VP0764）与甲醛灭活的SH112全菌疫苗分别免疫小鼠，三免后7 d 采血分离血清，以副溶血弧菌全菌作为包被原采用间接ELI⁃SA[15]方法检测血清效价水平。结果显示，His-OmpA（VP0764）重组蛋白免疫组小鼠的血清效价水平虽然低于全菌免疫的对照组，但与PBS组比较有部分升高（p<0.05）（图7）。表明该纯化的His-OmpA（VP0764）重组蛋白可以促使小鼠体内产生对SH112 菌的体液免疫应答反应。

图6 副溶血弧菌和其它非副溶血弧菌全菌蛋白的western blot 鉴定Fig. 6 Identification of whole bacterial protein of V. parahaemolyticus stains and non-V. parahaemolyticus stains by western blot

图7 3 免7 d 后小鼠体内抗体水平的ELISA 检测Fig. 7 The detection of antibodies in mice serum collected at the seventh day post the third immunizations

攻菌保护试验结果显示，攻菌后24 h 内SH112灭活菌组共死亡4 只小鼠，His-OmpA（VP0764）重组蛋白组共死亡9 只小鼠，空白对照组死亡14 只小鼠，全菌组的免疫保护率约为73%，重组蛋白组免疫保护率约为40%（图8）。表明His-OmpA（VP0764）重组蛋白对小鼠产生了部分免疫保护作用。后期研究计划进一步筛选其它具有保护性作用的蛋白，做串联表达，增加保护率。

图8 各组小鼠攻菌后的存活率Fig. 8 Survival rate of mice in each group after challenge in mice

3 讨 论

副溶血弧菌广泛存在于海洋湖泊中，对人和海洋生物具有严重致病性。由它导致的疾病发病率高，流行范围广，造成的经济损失较大[13]。目前控制该病的主要措施是使用抗生素，但抗生素的滥用所导致的耐药性已日益严重。病原体表面存在多种抗原，仅有少数抗原可以诱导机体产生特异性抗体。研究发现，OmpA 在许多细菌中为有效抗原，具有作为亚单位疫苗的潜力[14]。

生物信息学（Bioinformatics）是近几年发展起来的可用于研究生物学问题的交叉学科[15]。基于生物信息技术在蛋白质结构预测方面的优势，为基因工程亚单位疫苗的研究提供良好的技术支持。本研究利用生物信息学技术对副溶血弧菌OmpA（VP0764）蛋白的序列比对，几种主要弧菌物种间存在显著同源性，而且不同副溶血弧菌菌株之间的完全保守，通过对其基本理化性质、二级及三级结构和优势抗原表位等进行预测分析， 结果显示， OmpA（VP0764）蛋白为亲水性蛋白，无跨膜结构，存在信号肽序列，含有优势细胞抗原表位，定位于细胞膜外，其具有高度的稳定性、保守性和广泛分布，具有较好的免疫原性[16-17]，提示该蛋白有可能作为一种多功能的候选疫苗，为副溶血弧菌OmpA 相关亚单位疫苗的研究提供参考。

用表达的纯化的His-OmpA（VP0764）重组蛋白免疫小鼠获得多克隆血清进行western blot 鉴定，结果发现该免疫血清可与副溶血弧菌全菌蛋白和重组蛋白有特异性反应，而与提取的霍乱弧菌、创伤弧菌等非目的菌的全菌蛋白无特异性反应，表明针对重组蛋白的免疫血清可以识别副溶血弧菌的天然蛋白，且具有良好的特异性，以上结果为该蛋白作为保护性抗原奠定了理论基础，同时还提示其可作为副溶血弧菌检测的一个靶标蛋白。另外需要说明的是OmpA 基因理论上编码分子量为33.8 ku，但在western blot 分析中实际条带高于33.8 ku，分析可能原因是OmpA 超蛋白家族又称热休克蛋白，这种热休克蛋白由于蛋白富含折叠结构，一旦经过加热时，分子构象容易改变，使得其的不对称性增加，经SDS-PAGE 电泳的速度会降低，因此在western blot 实验结果中可以明显看出目的条带有所上移。

采用His-OmpA（VP0764）重组蛋白进行小鼠保护性实验，以评估该重组蛋白免疫对副溶血性弧菌感染的潜在免疫保护作用。免疫该重组蛋白的小鼠获得抗副溶血弧菌的特异性抗体。三免后腹腔攻击副溶血弧菌SH112 株，接种该重组蛋白的小鼠获得了一定的免疫保护作用。然而该重组蛋白免疫组小鼠的保护率显著低于灭活全菌免疫组，说明单一的抗原不足以使小鼠产生较高的保护力，前期研究发现SH112 株OmpA（VP1186）蛋白对小鼠也有约35%的保护率[18]，因为不同的OmpA 蛋白分子具有不同的结构域，可分别产生一定的免疫保护性，提示多种保护性蛋白结合在一起可能提高总体的免疫保护性。此外，副溶血弧菌对水产养殖的危害也非常巨大，如南美白对虾早期死亡综合征的病原主要是副溶血弧菌[19]，后期研究将尝试将多种具有保护性作用的OmpA 重组蛋白组合或串联表达，同时以水产动物为模型，进一步研究OmpA 对水产动物的免疫保护作用，以期为副溶血弧菌蛋白功能研究和疫苗的开发奠定基础。