大肠杆菌诱导奶牛乳腺成纤维细胞MMP-2、MMP-9 和uPA 系统表达的研究

赵 楠，缪增强，丁玉林，陈旭楠，程慧欣，王凤龙

（内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

奶牛乳腺炎（Dairy mastitis）是一种由多种病原微生物引起的奶牛乳腺的炎症，是奶牛的常见病之一。患有乳腺炎的奶牛乳汁异常，乳产量下降，从而给奶牛产业造成严重的损失。引起奶牛乳腺炎的病原有病毒、细菌、支原体和真菌等，但大多数为细菌性感染，其中以大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. au⁃reus）、链球菌（Streptococcus）为主，约占乳腺炎病原菌的90 %以上。大肠杆菌性乳腺炎通常表现为临床型乳腺炎，发病较急，如治疗不及时或治疗方法不当，会有较高的死淘率，部分病例转为慢性乳腺炎并使乳腺发生纤维化而失去泌乳功能。E. coli 侵入奶牛乳腺引起的奶牛乳腺炎，在炎症发展早期，成纤维细胞（Fibroblasts，FB）无明显病理变化，但到了急性炎症的后期，由于E. coli 对乳腺造成持续损伤使组织内稳态无法恢复，多种炎症细胞合成并释放细胞因子，引起FB 的增生和活化，并分泌胶原蛋白（Collagen，COL）导致细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）累积，使炎症由急性转为慢性，乳腺组织出现不同程度的纤维化。

纤溶酶原激活物（Plasminogen activator，PA）包括组织型纤溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator，tPA）和尿激病原菌酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，uPA）。uPA系统包括uPA、尿激酶型纤溶酶原激活受体（uPA recep⁃tor，uPAR）和纤溶酶原激活因子抑制物（Plasmino⁃gen activators inhibitor，PAI）。uPA 是一种分子量为5 200 ku 的丝氨酸蛋白酶，uPAR 是一种高度糖基化的糖蛋白，分子量在50 ku～60 ku，属于糖基化磷脂酞肌醇蛋白受体，含有3 个重复的氨基酸序列，每个序列含约90 个氨基酸残基[1]。uPAR 含有3 个同源但相互独立的异构结构域，其N 端87 个氨基酸残基是uPA 的A 链生长因子特异性结合的区域，而另外2 个结构域与uPAR 定位于细胞膜有关[2]。uPA 最初以无酶活性的单链酶原（pro-uPA）的形式分泌到细胞间质中，离开细胞后可与细胞膜上的uPAR 结合而被激活，或被纤维蛋白酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、胰蛋白酶等蛋白酶作用而激活[3]。PAIs 是PA 的特异抑制剂，主要包括PAI-1、PAI-2，其中PAI-1 是uPA 的主要抑制剂，活性远高于PAI-2，PAI-1 在纤维蛋白溶解中具有重要的调控作用，并有组织修复和炎症修复等作用。uPAR 与uPA 结合的结构不仅使uPA 位于细胞表面并形成促进纤溶酶（Plasmin，PL）产生的环境，而且还可激活uPA，活化的uPA 则通过酶促反应将纤溶酶原（Plasminogen，PLG）激活为PL 等成分，引起ECM 降解，产生蛋白裂解的级联反应。有研究表明，uPA 基因敲除的小鼠可自发性出现肝脏、肺脏及其他脏器ECM 累积，诱发组织纤维化形成[4]，也有研究表明PAI-1 基因缺失可以延缓纤维化进程[5]。同时，PL 的裂解可以将基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）的初始无活性的酶原形式（pro-MMPs）激活为具有活性的MMPs，而MMPs 是降解ECM 的一种主要蛋白酶，其中MMP-2 和MMP-9 属于MMPs 的胶原酶类。

在对组织和器官纤维化机制的研究中，已有MMPs 和uPA 系统在肺纤维化、肝纤维化、心肌纤维化、关节炎等中的作用研究，而对其在奶牛乳腺纤维化的作用研究较少。本实验室的前期研究已证明，在E. coli 和S. aureus 等可促进奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞表达转化生长因子-1（Transforming growth factor-1，TGF-β1）、核转录因子kappa B（Nu⁃clear factor kappa B，NF-κB）、碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）、血小板源性生长因子（Platelet derived growth factor，PDGF）等多种细胞因子，从而导致ECM 增多[6-9]。为了明确奶牛细菌性乳腺炎导致乳腺纤维化降解方面的机理，本实验室已研究了S. aureus 对奶牛乳腺成纤维细 胞（Bovine mammary fibroblasts， BMFB）MMPs、TIMPs 和uPA 系统表达的影响[10]，在前期研究基础上，本研究通过对E. coli 作用BMFB 后的MMP-2、MMP-9 和uPA 系统表达影响的研究，以阐明MMP-2、MMP-9 和uPA 系统在奶牛乳腺纤维化中的作用，为奶牛乳腺纤维化发病机理的研究和治疗药物靶点的选择提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 菌种及主要试剂E. coli 由本实验室分离、鉴定、保存；BMFB 由本实验室保存[11]。Multisource Total RNA Miniprep Kit 购自AXYGEN 公司；全蛋白提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；反转录试剂盒和qPCR 试剂盒购自TaKaRa 公司；DMEM/F12 培养基购自Gibco 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所；鼠抗βactin 单 克 隆 抗 体（MAb）购 自Abcam 公 司；兔 抗MMP-2 多克隆抗体、兔抗MMP-9 多克隆抗体、兔抗uPA 多克隆抗体、兔抗uPAR 多克隆抗体、兔抗PAI-1 多克隆抗体购自Proteintech 公司；山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP 购自天津三箭生物技术股份有限公；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、丙烯酰胺（29∶1）购自北京索莱宝科技有限公司；ECL显色液、蛋白预染Maker 购自Thermo 公司；MMP-2和MMP-9 明胶酶谱法检测试剂盒购自上海信帆生物科技有限公司。

1.2 热灭活菌液的配置将冻存的E. coli 于37 ℃复苏24 h 扩增培养，根据实验室前期研究摸索选取的适宜浓度[6]，采用平板活菌计数法测定菌液浓度，以无血清的DMEM/F12 培养液将菌液稀释至1×105cfu/mL、1×106cfu/mL 和1×108cfu/mL。将不同浓度的菌液采用70 ℃高温处理30 min 灭活，灭活的菌液用血琼脂培养24 h 无菌落生长即可作为作用菌液。如果采用活菌作用，其浓度会随着作用时间的延长而变化，并且其代谢产物会对细胞造成不可控的影响，所以本实验参考文献采用灭活菌作用细胞[12]。

1.3 细胞的准备及菌液的作用将冻存的第3 代BMFB 复苏并传代培养，到第7 代且细胞形态轮廓清晰，长满单层后，加入无血清培养液对细胞饥饿处理24 h 后，处理组加入1 mL 不同浓度灭活的E.coli菌液（1×105cfu/mL、1×106cfu/mL和1×108cfu/mL），对照组加入1 mL 无血清的细胞培养液，分别作用6 h、12 h、24 h、48 h 收集细胞，用于提取细胞上清液、总RNA 和总蛋白。

1.4 MMP-2、MMP-9、uPA、uPAR和PAI-1 mRNA转录水平的RT-qPCR 的检测由上海生工生物技术服务有限公司设计合成β-actin、MMP-2、MMP-9、uPA、uPAR、PAI-1 引物（表1）。按照RNA 提取试剂盒说明书步骤将不同浓度（1×105cfu/mL、1×106cfu/mL和1×108cfu/mL）灭活的E.coli 菌液作用后的处理细胞和对照细胞在作用6 h、12 h、24 h、48 h 后分别提取BMFB 细胞总RNA，反转录为cDNA。以β-actin作为内参基因，利用RT-qPCR 试剂盒检测MMP-2、MMP-9、uPA、uPAR 和PAI-1 的mRNA 转录水平。

表1 qPCR 引物序列Table 1 qPCR primer sequences

1.5 MMP-2、MMP-9、uPA、uPAR、PAI-1 蛋白表达的western blot 检测利用全蛋白提取试剂盒提取BMFB 细胞总蛋白，采用BCA 试剂盒检测蛋白浓度，煮沸变性后-80 ℃保存备用。分别以鼠抗β-actin MAb（1∶1 000）、兔抗MMP-2多克隆抗体（1∶500）、兔抗MMP-9 多克隆抗体（1∶500）、兔抗uPA 多克隆抗体（1∶300）、兔抗uPAR 多克隆抗体（1∶300）、兔抗PAI-1 多克隆抗体（1∶500）为一抗。山羊抗小鼠IgG-HRP（1∶4 000）、山羊抗兔IgG-HRP（1∶3 000）为二抗，采用western blot 检测MMP-2、MMP-9、uPA、uPAR和PAI-1 蛋白的表达。

1.6 明胶酶谱活性检测制备含MMP 底物蛋白的SDS-PAGE 凝胶，将不同浓度（1×105cfu/mL、1×106cfu/mL 和1×108cfu/mL）灭活的E. coli 菌液作用后的处理组和对照组在作用6 h、12 h、24 h、48 h 后提取的细胞上清液与2×SDS-PAGE 缓冲液1∶1 混合后上样，利用明胶酶谱检测试剂盒检测MMP-2 和MMP-9 的酶活性。

1.7 数据分析qRT-PCR 的结果数据处理采用2-ΔCT法，western blot 条带和明胶酶谱条带用ImageJ 软件进行灰度值分析，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值表示蛋白结果相对定量。然后进行统计分析，各组内差异采用双因素方差分析，以p<0.05 表示差异具有统计学意义（*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001），采用GraphPad Prism5 制作柱状图。

2 结 果

2.1 热灭活E. coli作用BMFBs 后MMP-2 和MMP-9 mRNA 转录水平和蛋白表达及明胶酶谱分析

2.1.1 热灭活E. coli 作用BMFBs 后对MMP-2 mRNA转录水平和蛋白表达的影响 不同浓度的热灭活E.coli在作用BMFBs 6 h、12 h、24 h、48 h 后，RT-qPCR结果显示，MMP-2 的mRNA 转录水平与对照组相比，除作用6 h 1×105cfu/mL、1×106cfu/mL 和作用48 h 1×106cfu/mL 处理组差异不显著（p>0.05），其他各浓度处理组在各时间点的转录水平均升高，其中1×105cfu/mL 处理组和1×106cfu/mL 处理组在作用12 h和24 h 均极显著升高（p<0.001），1×108cfu/mL 处理组在作用24 h 和48 h 水平极显著升高（p<0.001）（图1）。Western blot 结果经灰度值分析结果显示，MMP-2 的蛋白表达与对照组相比，除作用6 h 1×108cfu/mL处理组极显著升高（p<0.001）外，其余各浓度组均在作用6 h和12 h极显著下降（p<0.001），在作用24 h极显著升高（p<0.001）；在作用48 h 与对照组1×106cfu/mL 处理组极显著下降（p<0.001），其他各浓度组均与对照组差异不显著（p>0.05）（图2B）。结果表明，热灭活E. coli 作用BMFBs 后MMP-2 的mRNA 转录水平与对照组相比呈上升趋势，无明显的浓度依赖性，蛋白表达水平与对照组相比主要呈先降低后升高再降低的趋势，在作用6 h 和24 h 具有浓度依赖性。

图1 不同浓度的E. coil 作用BMFB 不同时间后MMP-2 mRNA 的转录水平Fig. 1 The transcription levels of MMP-2 mRNA in BMFB treated with different concentrations of E. coil at different times

2.1.2 热灭活E. coli 作用BMFBs 后对MMP-9 mRNA转录水平和蛋白表达的影响 不同浓度的热灭活E.coli在作用BMFBs 6 h、12 h、24 h、48 h后，RT-qPCR结果显示，MMP-9 mRNA转录水平与对照组相比，各浓度处理组在作用6 h和12 h以及1×105cfu/mL处理组在作用48 h 差异均不显著（p>0.05），1×105cfu/mL 处理组在作用24 h 极显著升高（p<0.01），1×106cfu/mL 处理组在作用24 h显著升高（p<0.05），在作用48 h极显著升高（p<0.001），1×108cfu/mL 处理组在作用24 h 和48 h均极显著升高（p<0.001）（图3）；Western blot结果显示，MMP-9蛋白的表达与对照组相比，除1×105cfu/mL处理组在作用12 h 和24 h 以及1×106cfu/mL 处理组在作用24 h差异不显著（p>0.05）外，其余浓度处理组在作用6 h均极显著升高（p<0.01），在作用12 h均极显著下降（p<0.01），在作用24 h 和48 h 均极显著升高（p<0.001）（图4B）。结果表明，热灭活E.coli 作用BMFBs后MMP-9 mRNA 转录水平与对照组相比呈升高趋势且具有时间依赖性，蛋白表达水平与对照组相比主要呈先升高后下降再升高的趋势且具有时间依赖性和浓度依赖性，BMFBs 中MMP-9 的表达水平在热灭活E. coli 作用的后期升高。

图2 不同浓度的E. coil 作用BMFB 不同时间后MMP-2 蛋白的相对表达量Fig. 2 The expression of MMP-2 protein in BMFB treated with different concentrations of E. coil at different times

图3 不同浓度的E. coil 作用BMFB 不同时间后MMP-9 mRNA 的转录水平Fig. 3 The transcription levels of MMP-9 mRNA in BMFB treated with different concentrations of E. coil at different times

图4 不同浓度的E. coil 作用BMFB 不同时间后MMP-9 蛋白的相对表达量Fig. 4 The expression of MMP-9 protein in BMFB treated with different concentrations of E. coil at different times

2.1.3 热灭 活E. coli 作 用BMFBs 后MMP-2 和MMP-9 的明胶酶谱分析 不同浓度的热灭活E. coli 在作用BMFBs 6 h、12 h、24 h、48 h 后，利用明胶酶谱法检测MMP-2 和MMP-9 的活性，结果可见清晰的MMP-2 的条带，但MMP-9 条带不明显（图5A）。MMP-2 活性与对照组相比主要呈升高趋势，其中1×105cfu/mL 处理组与对照组相比在作用24 h 和48 h 差异极显著（p<0.001）；1×106cfu/mL 处理组在作用6 h、24 h 和48 h 差异极显著（p<0.001）；1×108cfu/mL处理组在作用12 h 和24 h 与对照组相比差异极显著（p<0.001）。MMP-9 的活性与MMP-2 相比变化不明显，其与对照组相比，仅在1×105cfu/mL 处理组作用6 h和12 h及1×108cfu/mL处理组在作用24 h差异显著（p<0.05），1×106cfu/mL处理组在作用12 h和24 h差异较显著（p<0.01），其余各组与对照组相比均差异不显著（p>0.05）（图5B）。结果表明热灭活E. coli 作用BMFB 后MMP-2 酶活性良好，在作用24 h 活性最强，而MMP-9 酶活性较弱。

2.2 热灭活E. coli作用BMFBs 后uPA、uPAR 和PAI-1 mRNA 转录水平和蛋白表达的检测

2.2.1 热灭活E.coli作用BMFBs后对uPA mRNA转录水平和蛋白表达的影响 不同浓度的热灭活E.coli 在作用BMFBs 6 h、12 h、24 h、48 h 后，RT-qPCR 结果显示，uPA mRNA 转录水平与对照组相比，1×105cfu/mL 处理组在作用12 h 极显著升高（p<0.001），在其余作用时间点转录水平无明显变化（p>0.05），1×106cfu/mL 处理组在作用24 h 和48 h 极显著升高（p<0.01），在其余作用时间点转录水平无明显变化（p>0.05），1×108cfu/mL 处理组在作用12 h、24 h 和48 h 极显著升高（p<0.01），在其余作用时间点转录水平无明显变化（p>0.05）（图6）；Western blot 结果经灰度值分析结果显示，与对照组相比1×105cfu/mL 处理组在uPA 蛋白的表达水平作用6 h 显著升高（p<0.05），在作用24 h 极显著下降（p<0.01），在其余作用时间点其表达水平无明显变化（p>0.05）；与对照组相比，1×106cfu/mL 处理组在作用12 h uPA 蛋白的表达水平显著下降（p<0.05），在其余作用时间点表达水平无明显变化（p>0.05）；1×108cfu/mL处理组在作用12 h蛋白表达极显著下降（p<0.01），在作用24 h 和48 h 表达极显著升高（p<0.01），在其余作用时间点表达水平无明显变化（p>0.05）（图7）。结果表明，热灭活E. coli 作用BMFBs 后uPA 的mRNA 转录水平与对照组相比主要呈上升趋势，蛋白水平与对照组相比主要呈先上升后下降再上升的趋势，均无明显的浓度依赖性。

图5 不同浓度的E. coli 作用BMFB 不同时间后MMP-2 和MMP-9 的 明 胶 酶 谱Fig. 5 Gelatin zymograms of MMP-2 and MMP-9 in BMFB treated with different concentrations of E. coli at different times

图6 不同浓度的E. coil 作用BMFB 不同时间后uPA mRNA 的转录水平Fig. 6 The transcription levels of uPA mRNA in BMFB treated with different concentrations of E. coil at different times

图7 不同浓度的E. coil 作用BMFB 不同时间后uPA 蛋白的相对表达量Fig. 7 The expression of uPA protein in BMFB treated with different concentrations of E. coil at different times

2.2.2 热灭活E.coli 作用BMFBs 后uPAR mRNA 转录水平和蛋白表达的影响 不同浓度的热灭活E.coli在作用BMFBs 6 h、12 h、24 h、48 h后，RT-qPCR检测结果显示，uPAR 的mRNA 转录水平与对照组相比，1×105cfu/mL 处理组在作用12 h 显著升高（p<0.05），1×106cfu/mL 处理组在作用24 h 极显著升高（p<0.001），在作用48 h显著升高（p<0.05），1×108cfu/mL处理组在作用24 h和48 h极显著升高（p<0.001），其余各处理组均不显著（p>0.05）（图8）；Western blot 检测结果显示，uPAR 的蛋白表达与对照组相比，1×108cfu/mL 处理组在作用6 h 极显著升高（p<0.01），1×105cfu/mL 处理组在作用12 h 极显著升高（p<0.001），1×106cfu/mL处理组在作用12 h 显著升高（p<0.05），各浓度处理组在作用48 h 均极显著下降（p<0.001），其余各处理组均不显著（p>0.05）（图9）。结果表明，热灭活E. coli 作用BMFBs 后uPAR 的mRNA 转录水平与对照组相比主要呈上升趋势，且具有时间依赖性和浓度依赖性，蛋白水平与对照组相比要呈先升高后下降的趋势且具有时间依赖性，在作用12 h 和48 h 具有明显的浓度依赖性。

图8 不同浓度的E. coil 作用BMFB 不同时间后uPAR mRNA 的转录水平Fig. 8 The transcription levels of uPAR mRNA in BMFB treated with different concentrations of E. coil at different times

图9 不同浓度的E. coil 作用BMFB 不同时间后uPAR 蛋白的相对表达量Fig. 9 The expression of uPAR protein in BMFB treated with different concentrations of E. coil at different times

2.2.3 热灭活E.coli 作用BMFBs 后PAI-1 mRNA 转录水平和蛋白表达的影响 不同浓度的热灭活E.coli 在作用BMFBs 6 h、12 h、24 h、48 h后，RT-qPCR检测结果显示，PAI-1 的mRNA 转录水平与对照组相比，1×105cfu/mL处理组在各时间点均不显著（p>0.05），1×106cfu/mL 处理组在作用24 h 和48 h 表达极显著升高（p<0.01），在其余时间点不显著（p>0.05），1×108cfu/mL处理组在作用24 h 和48 h 表达极显著升高（p<0.001），在其余时间点不显著（p>0.05）（图10）；Western blot 检测结果显示，PAI-1的蛋白表达与对照组相比，除6 h 1×105cfu/mL 处理组不显著（p>0.05）、1×108cfu/mL 处理组在作用6 h 显著降低（p<0.05）以及在作用12 h 极显著降低（p<0.01）以外，其余各浓度处理组在作用6 h、12 h和48 h均极显著下降（p<0.001），在作用24 h表达极显著上升（p<0.001）（图11）。结果表明，热灭活E. coli 作用BMFBs 后PAI-1 的mRNA 转录水平与对照组相比主要呈上升趋势且具有时间依赖性，蛋白水平与对照组相比主要呈先降低后升高再降低的趋势，且具有明时间依赖性，在作用24 h 和48 h 具有明显的浓度依赖性。

图10 不同浓度的E. coil 作用BMFB 不同时间后PAI-1 mRNA 的转录水平Fig. 10 The transcription levels of PAI-1 mRNA in BMFB treated with different concentrations of E. coil at different times

图11 不同浓度的E. coil 作用BMFB 不同时间后PAI-1 蛋白的相对表达量Fig. 11 The expression of PAI-1 protein in BMFB treated with different concentrations of E. coil at different times

3 讨 论

奶牛乳腺炎转为慢性多引起乳腺发生不同程度的纤维化，ECM 的合成和降解是影响纤维化发生的重要原因，MMPs 系统是调控ECM 代谢的主要酶系，其中MMP-2 和MMP-9 同属于MMPs 家族中的明胶酶类，主要降解基膜成分中的明胶和IV 型胶原。MMPs 的催化活性主要受到基因表达、酶原活化和活化后调节3 个方面的调控。实验结果显示，不同浓度的热灭活E. coli 菌液作用BMFB 后，MMP-2 和MMP-9 mRNA 转录水平均呈升高趋势，MMP-9 蛋白表达水平主要呈先升高后降低再显著升高的趋势，并具有时间和浓度依赖性，MMP-2 蛋白表达水平主要呈先降低后显著升高再降低的趋势，但对浓度依赖性不明显，说明热灭活E. coli 诱导BMFB 分泌MMP-2 和MMP-9 来 降 解ECM，同 时MMP-2 和MMP-9 也会受到其他酶类的调控而表达下降，对ECM 的降解减少而促进纤维化的进程，如基质金属蛋白酶抑制剂（Tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs）作为MMPs 内源性的特异抑制剂，对MMP 有很强的抑制作用，有研究证明S. aureus 诱导的BMFB 中TIMP-1 和TIMP-2 的 表 达 增 多[10]，TIMPs 表达的增多抑制MMP-2 和MMP-9 的表达，也有研究表明I 型胶原和IV 型胶原在早期还可以降解MMP-2[13]，这些ECM 分子在早期的表达以及TIMPs 对MMPs 的抑制作用可能是MMP-2 蛋白水平在早期表达下降的原因。有文献报道，在肝纤维化模型中，MMP-2 和MMP-9 的表达在纤维化过程的中期最高然后随着纤维化程度的加重而下降[14]，本研究MMP-2 在纤维化过程中的变化与文献报道相似。在陈梦娟的研究中也证明了E. coli 菌液作用BMFB后，ECM 的主要成分COLIα1 随作用时间的延长表达量增加，纤维化加重[15]。明胶酶谱实验结果显示，MMP-2 的酶活性远高于MMP-9 的酶活性，这一结果与Miao 研究的S. aureus 诱导BMFB 后MMP-2和MMP-9 的酶活性结果类似[10]。在Takashi 等人的研究结果表明，在仓鼠皮肤成纤维细胞中，E. coli细胞壁所含成分肽聚糖（Peptidoglycan，PGN）可以通过促进pro-MMP-2 的表达来促进pro-MMP-2 的产生[16]。MMP-2 和MMP-9 在纤维化过程中具有两个方面的作用，在炎症早期是具有抗纤维化功能的酶，降解部分过多的ECM，减缓纤维化进程，在炎症后期又可作为炎症前介质，促进细胞增生，启动并加重纤维化进程。有研究证明MMP-2 基因敲除的小鼠与野生型对比，纤维化更严重[17]。因此，MMP-2和MMP-9 在奶牛乳腺纤维化中的抗纤维化或促纤维化作用有待进一步研究。

调控ECM 代谢的主要酶系除了MMPs 系统还有uPA 系统，uPA 系统不仅参与纤溶蛋白的降解，也可以促进MMPs 的活化。本实验结果显示，不同浓度的热灭活E. coli 菌液作用BMFB期间，uPA、uPAR和PAI-1 mRNA 转录水平主要呈升高趋势，uPA 和uPAR 蛋白的表达水平主要呈先升高后降低的趋势，而PAI-1 蛋白的表达水平主要呈先降低后升高再降低的趋势，且PAI-1 升高的趋势更显著，其中uPAR 和PAI-1 具有明显的时间和浓度依赖性，而uPA 对二者的依赖性则不明显，说明热灭活E. coli菌液诱导BMFB 分泌uPA、uPAR 和PAI-1 表达量的升高，显著升高的PAI-1 可以抑制uPA 与uPAR 的结合，导致其对ECM 的降解下降，加快纤维化的进程，进而影响uPA 对MMPs 活化的促进作用。有研究表明，在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化研究中，在肝纤维化形成的早期uPA 和uPAR 表达量增加，而PAI-1 表达变化不大，随着肝纤维化发展，uPA、uPAR 和PAI-1 的表达量均有增加，但PAI-1 的表达量更显著增加[18]，这一结果与本实验结果相类似。本实验室前期实验已证明，E. coli 菌液作用BMFB可以诱导TGF-β1 和bFGF 的表达，促进纤维化的发展[9]。文献报道，bFGF 可以很快通过自分泌发挥作用，刺激细胞分泌uPA 和胶原酶，uPA 又可以促进TGF-β1 前体的激活[19]。对胆道闭锁肝纤维化的研究发现，TGF-β1 通过整合素蛋白等因素的启动促进PAI-1 的生成[20]，进而抑制uPA 和uPAR 的表达。

uPA 系统、PL 和MMPs 构成的级联激活反应是调节ECM 累积的关键途径之一，uPA 位于这个级联激活反应的顶端，可以促进MMPs 与PL 一同降解ECM 等基膜成分，从而参与炎症反应，抑制纤维化的进程。有研究证明uPA 可以依赖基质成纤维细胞的方式参与MMP-2 的活化，导致表皮基底和毛囊中过度表达uPA 和uPAR，从而激活MMP-2和MMP-9[21]。本研究结果表明，热灭活E. coli 作用BMFB 早期uPA 系统被激活表达，参与了MMP-2 和MMP-9 的激活与调控，促进了ECM 代谢，随着作用时间延长，uPA 和uPAR 的表达与MMP-2 和MMP-9 的表达相比先下降，这可能是因为PAI-1 的显著升高抑制了uPA 和uPAR 的表达，进而抑制了其对MMP-2 和MMP-9 活化的促进作用，加快纤维化的进程，这可能是MMP-2、MMP-9 和uPA 系统在奶牛乳腺纤维化中的潜在机制。本研究为理解MMPs 和uPA 系统在奶牛乳腺纤维的机制奠定基础，并为治疗奶牛乳腺腺纤维化药物靶点的筛选提供参考。