猫爪草总皂苷通过下调信号素4D表达抑制人非小细胞肺癌A549细胞增殖

童晔玲，任泽明，陈 璇，陈思思，朱佳依，戴关海

（浙江省中医药研究院，浙江省中药新药研发重点实验室，浙江 杭州 310007）

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中80%～85%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其恶性程度高，生物学特性复杂，且预后差，缺少早期诊断及有效的治疗手段，5年生存率＜15%［1］。西医治疗NSCLC以手术、放化疗和靶向治疗为主。中医药治疗有其独特的优势，从中草药中筛选有效的、靶向性高的肿瘤防治药物是近年来的研究热点。

中药猫爪草（Ranunculus ternatus Thunb.）性温，味甘、辛，入肝、肺经，具有化痰散结、解毒消肿等功效，临床用于治疗瘰疬痰核、疔疮肿毒、蛇虫咬伤等［2］。近年来，猫爪草在中医临床上用于治疗肿瘤，对肺癌、淋巴癌、甲状腺瘤和乳腺肿瘤等均有较好的治疗效果。猫爪草总皂苷（total saponin of R.ternatus，TSRT）和多糖是其主要活性成分，对人胃癌BGC823细胞［3］、人乳腺癌MCF-7细胞［4］和肝癌H22细胞［5］等生长均有较好的抑制作用。本课题组前期研究发现，TSRT体外能较好地抑制人NSCLC A549和NCI-H460细胞的增殖，体内能有效抑制A549裸鼠移植瘤生长［6-8］，并通过高通量测序技术检测TSRT治疗NSCLC A549细胞的相关基因，筛选差异表达基因，结合GO功能分析、Pathway富集分析、荧光定量PCR验证，最终聚焦到信号素4D（semaphorin 4D，Sema4D）。本研究观察TSRT对Sema4D过表达慢病毒感染的A549细胞增殖的影响，并初步阐明其抗NSCLC的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和主要仪器

人NSCLC A549细胞，来源于中国科学院上海细胞库。RPMI 1640培养基、0.25%胰蛋白酶（含0.02% EDTA）和PBS购于吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清购于浙江天杭生物科技股份有限公司；Sema4D过表达慢病毒载体（LV-Sema4D）和阴性对照慢病毒载体（LV-negative control，LV-NC）委托吉玛制药技术有限公司（上海）合成；Trizol购于美国Invitrogen公司；异丙醇、正丁醇和石油醚购于成都市科龙化工试剂厂；三氯甲烷购于南京化学试剂有限公司；无水乙醇购于安徽安特食品股份有限 公 司 ；Sema4D、丛 状 蛋 白 B1（PlexinB1，PlxnB1）、酪氨酸蛋白激酶（CENP-meta，c-Met）和真核翻译延伸因子1α（eukaryotic translation elongation factor-1α，EF-1α）引物购于生工生物工程（上海）股份有限公司；逆转录和荧光定量PCR试剂盒购于日本Takara公司；全蛋白提取试剂盒购于江苏凯基生物技术股份有限公司；WES全自动蛋白定量分析试剂盒（12～230 ku）购于美国Protein Simple公司；兔抗人Sema4D，PlxnB1和c-Met单克隆抗体购于英国Abcam公司；兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体购于美国Proteintech公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、Alexa Fluor 647标记山羊抗兔IgG抗体和嘌呤霉素购于碧云天生物技术公司；Triton X-100和牛血清白蛋白购于上海泽衡生物技术有限公司；多聚甲醛、DAPI染色液和抗荧光淬灭封片剂购于博士德生物工程有限公司。

3111型CO2培养箱，美国Thermo公司；ECLIPSE Ti型倒置荧光显微镜，日本Nikon公司；Centrifuge 5810R低温离心机，德国Eppendorf公司；HR40-Ⅱ-A2型医用净化工作台，青岛海尔特种电器有限公司；细胞培养板，美国Costar公司；xCELLigence RTCA DP多功能实时无标记细胞分析仪，艾森生物（杭州）有限公司；E-Plate 16检测板，艾森生物（杭州）有限公司；7500型实时荧光定量PCR仪，美国ABI公司；Nanodrop2000核酸蛋白质定量仪、超低温冰箱，美国Thermo公司；WES全自动蛋白定量分析仪，美国Protein Simple公司；LSM800激光共聚焦显微镜，德国Zeiss公司。

1.2 药物和TSRT的制备

猫爪草购于华东医药股份有限公司，经鉴定为毛茛科植物小毛茛的干燥块根。猫爪草粉碎成粗颗粒，加入6倍量85%乙醇提取3 h；过滤，滤液减压回收乙醇，用石油醚萃取2次；再以水饱和正丁醇萃取3次，正丁醇萃取液用0.1 mol·L-1NaOH萃取2次，正丁醇液回收至干，得总皂苷；以人参皂苷Rb1为对照品测得总皂苷含量为62.33%。临用前用培养液溶解，过滤除菌，4℃冰箱内保存备用。

1.3 细胞培养和慢病毒感染

A549细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，置37℃，5% CO2培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。构建Sema4D过表达慢病毒载体LV-Sema4D（3×1011TU·L-1）及阴性对照慢病毒载体LV-NC（9×1011TU·L-1），A549细胞按5×107L-1，每孔500 μL接种于24孔板中，培养24 h后以最佳病毒感染复数（multiplicity of infection，MOI）=10加入过表达慢病毒及阴性对照病毒感染A549细胞，并加入聚凝胺Polybrene 5 mg·L-1以增加感染效率。24 h后更换完全培养基继续培养48 h，倒置荧光显微镜观察荧光强度。用嘌呤霉素1.0 mg·L-1连续筛选14 d得到稳定转染细胞株。

1.4 实验分组

实验分4组：感染Sema4D过表达慢病毒的A549细胞为过表达组（LV-Sema4D组），感染Sema4D过表达慢病毒的A549细胞加入TSRT 100 mg·L-1干预为给药组（LV-Sema4D+TSRT组），感染阴性对照病毒的A549细胞为阴性对照组（LV-NC组），未感染慢病毒的A549细胞为细胞对照组。

1.5 实时细胞分析系统（RTCA）连续检测细胞指数

取对数生长期的细胞，调整细胞密度为5×107L-1，先在E-Plate板上每孔放入50 μL培养基测基线，随后按照1.4分组加入Sema4D 100 μL过表达慢病毒感染的A549细胞、感染阴性对照病毒的A549细胞或未感染慢病毒的A549细胞，每组3复孔，置37℃，5% CO2培养箱中培养24 h，记录细胞指数（cell index，CI）。随后给药组加100 mg·L-1TSRT干预，继续培养72 h，记录48，72和96 h CI。

1.6 荧光定量PCR检测Sema4D，PlxnB1和c-Met mRNA表达

取对数生长期细胞，调整密度为5×107L-1，按照1.4分组接种细胞于24孔板中，每孔500 μL，每组3复孔，37℃，5% CO2培养箱中培养，24 h后给药组加入TSRT 100 mg·L-1干预，继续培养48 h，收集细胞用Trizol法提取总RNA，按照试剂盒说明进行逆转录反应和实时PCR检测。引物序列见表1，EF-1α为内参基因。逆转录反应条件：37℃15 min，85℃ 5 s，4℃保存。PCR 反应条件：95℃，30 s；95℃，5 s，60℃，30 s，40个循环；熔解曲线95℃，15 s，60℃，60 s，95℃，15 s。采用相对定量分析方法（2-ΔΔCt法）进行分析。

Tab.1 Primer sequences for PCR

1.7 Western印迹法检测Sema4D，PIxnB1和c-Met蛋白表达

取对数生长期的细胞，调整密度为5×107L-1，按照1.4分组接种细胞于6孔板中，每孔2.5 mL，每组3复孔，37℃，5% CO2培养箱中培养，24 h后给药组加入TSRT 100 mg·L-1干预，继续培养48 h，收集细胞用全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白质浓度。按照WES全自动蛋白定量分析试剂盒的操作说明，在反应板内每孔依次加入蛋白样品3 μL，抗体稀释液10 μL，兔抗人Sema4D、PlxnB1和c-Met抗体（一抗，1∶50稀释）10 μL，兔抗人GAPDH抗体（内参，1∶1000稀释）10 μL，HRP标记山羊抗兔IgG抗体（二抗）10 μL，发光液15 μL，清洗缓冲液500 μL，用WES全自动蛋白定量分析仪进行检测，并用Compass软件进行峰面积（peak area，PA）分析，蛋白相对表达水平用PA目标蛋白/PA内参蛋白比值表示。

1.8 免疫荧光法检测Sema4D蛋白表达水平

取对数生长期的细胞，调整密度为5×107L-1，按照1.4分组接种细胞于6孔板中（内置细胞爬片），每孔2.5 mL，37℃，5% CO2培养箱中培养；24 h后给药组加入TSRT 100 mg·L-1干预，继续培养48 h，取出爬片；PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，吸干固定液；漂洗3次，0.1% Triton X-100穿孔10 min；漂洗3次，加入封闭缓冲液，室温轻摇封闭60 min；吸弃封闭液，滴加兔抗人Sema4D抗体（一抗，1∶50稀释），4℃孵育过夜；漂洗3次，滴加Alexa Fluor 647标记山羊抗兔IgG抗体（二抗，1∶500稀释），室温避光孵育2 h；漂洗3次，滴加DAPI避光孵育10 min；漂洗3次，吸弃液体，用抗荧光淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察并摄片，记录荧光强度（fluorescence intensity，FI）值变化，以FI值表示蛋白的相对表达水平。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 稳定表达Sema4D细胞株的鉴定

加入过表达慢病毒LV-Sema4D及阴性对照病毒LV-NC感染的A549细胞，用嘌呤霉素连续筛选14 d，置于倒置荧光显微镜下拍照（图1），可见明显的绿色荧光，表明稳定表达Sema4D细胞株构建成功。

Fig.1 EstabIishment of ceII Iines stabIy expressing semaphorin 4D（Sema4D）（×100）.LV-NC group：A549 cells infected with negative control virus；LV-Sema4D group：A549 cells infected with Sema4D overexpressing lentivirus.

2.2 TSRT对细胞指数的影响

由图2可见，与细胞对照组相比，LV-NC组增殖曲线无显著差异，LV-Sema4D组略有上升，LV-Sema4D+TSRT组明显下降。由表2可见，与细胞对照组相比，LV-NC组的48，72和96 h CI值无显著差异；与LV-NC组相比，LV-Sema4D组72 h CI值升高（P＜0.01），48和96 h CI值无显著差异；与LV-Sema4D组相比，LV-Sema4D+TSRT组48，72和96 h CI值均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 TSRT对A549细胞Sema4D，PlxnB1和c-Met mRNA表达的影响

由图3可见，与细胞对照组相比，LV-NC组Sema4D，PlxnB1和c-Met mRNA表达无显著差异；与LV-NC组相比，LV-Sema4D组上述3个mRNA表达均显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；TSRT 100 mg·L-1干预后，与LV-Sema4D组相比，上述3个mRNA表达均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.2 Effect of totaI saponin of Ranunculus Ternatus（TSRT）on ceII index of A549 ceIIs by reaI time ceII anaIysis.Cell control group：A549 cells；LV-NC group：A549 cells infected with negative control virus；LV-Sema4D group：A549 cells infected with Sema4D overexpressing lentivirus；LV-Sema4D+TSRT group：LV-Sema4D cells treated with TSRT 100 mg·L-1.±s，n=3.

Tab.2 Effect of TSRT on ceII index of A549 ceIIs by reaI time ceII anaIysis

Fig.3 Effect of TSRT on mRNA IeveIs of Sema4D，PlxnB1 and c-Met in A549 ceIIs by reaI-time PCR.See Fig.2 for the cell treatment for 48 h.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with LV-NC group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with LV-Sema4D group.

2.4 TSRT对A549细胞Sema4D，PIxnB1和c-Met蛋白表达的影响

由图4可见，与细胞对照组相比，LV-NC组Sema4D，PlxnB1和c-Met蛋白表达无显著差异；与LV-NC组相比，LV-Sema4D组上述3个蛋白表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；TSRT 100 mg·L-1干预后，与LV-Sema4D组相比，上述3个蛋白表达均显著降低（P＜0.05）。

2.5 TSRT对A549细胞Sema4D蛋白表达的影响

Fig.4 Effect of TSRT on Sema4D，PIxnB1 and c-Met expression in A549 ceIIs by Western bIotting.See Fig.2 for the cell treatment for 48 h.B was the semiquantitative result of A.PA：peak area.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with LV-NC group；#P＜0.05，compared with LV-Sema4D group.

Fig.5 Effect of TSRT on protein expression of Sema4D in A549 ceIIs by immunofIuorescence method（×200）.See Fig.2 for the cell treatment for 48 h.B was the semiquantitative result of A.FI：fluorescence intensity.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with LV-NC group；#P＜0.05，compared with LV-Sema4D group.

由图5可见，Sema4D的表达定位在细胞膜。与细胞对照组相比，LV-NC组Sema4D荧光强度无明显差异；与LV-NC组相比，LV-Sema4D组荧光强度显明显强（P＜0.01）；TSRT 100 mg·L-1干预后，与LV-Sema4D组相比，Sema4D荧光强度减弱（P＜0.05），提示TSRT干预可降低Sema4D蛋白的表达。

3 讨论

化痰祛瘀解毒为中医辨证论治肺癌的重要原则［9］。猫爪草具有化痰散结、解毒消肿之功效，是化痰祛瘀解毒中药的代表，也是中医临床治疗肺癌的常用药。皂苷类成分作为主要活性成分之一已显示出较好的抗肿瘤效果［3-8］。本研究所用TSRT的总皂苷含量为62.33%（以人参皂苷Rb1为对照品），其他成分主要为4-氧代-5-（O-β-D-葡萄糖基）-戊酸-正丁基酯、4-氧代-5-（O-β-D-葡萄糖基）-戊酸甲酯和苯甲醇O-β-D-葡萄糖苷等，未见明显的细胞毒性［10］。本课题组前期研究考察了TSRT抗A549细胞增殖的量-效关系和时-效关系，结合［3H］TdR同位素掺入实验、集落形成实验、RTCA-DP检测和CCK-8实验结果，提示TSRT 25～200 mg·L-1体外与人NSCLC A549和NCI-H460细胞作用24，48和72 h，均能抑制细胞增殖和集落形成，引起细胞凋亡，使细胞周期阻滞在G0/G1期［6-8］。通过高通量测序技术检测TSRT干预A549细胞后的相关基因改变，筛选获得＞200个差异表达基因；对差异基因作GO功能分析和Pathway富集分析，得到56个基因，这些基因主要富集在信号转导和细胞代谢等功能分类；经PCR验证和统计分析，信号素家族的Sema4D在肿瘤细胞中高表达，TSRT治疗后显著下调。进一步考察了TSRT 25～200 mg·L-1对无转染A549细胞Sema4D mRNA表达的影响，发现TSRT 50，100和200 mg·L-1作用48 h，可显著降低A549细胞Sema4D mRNA表达，且TSRT 100 mg·L-1作用最佳。因此，选择本研究选择该浓度。

本研究首先构建了稳定转染Sema4D的A549细胞株，以此为细胞模型观察TSRT对细胞增殖的影响。运用RTCA技术连续监测96 h CI值，结果表明，LV-NC组相比，LV-Sema4D组72 h CI值显著升高，TSRT干预后48，72和96 h CI值均显著降低。CI反映的是细胞数量和细胞黏附状态的变化，细胞数量越多，贴壁越好，CI越大。RTCA结果提示，稳定表达Sema4D的A549细胞增殖能力增强，而TSRT可逆转该效应。

Sema4D作为信号素家族的成员之一，在促进NSCLC增殖和转移中发挥重要作用。Sema4D在NSCLC中的阳性表达率明显高于肺良性病变组，在60例NSCLC患者中，Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期NSCLC的Sema4D阳性表达率分别为48.4%和82.8%。siRNA干扰后，A549细胞Sema4D mRNA和蛋白水平显著降低，且A549细胞增殖、侵袭和迁移可以通过沉默Sema4D基因来抑制，其机制可能与抑制蛋白激酶B磷酸化有关［11］。运用免疫组化方法检测95例肺癌组织和20例正常肺组织Sema4D表达水平。结果显示，肺癌组织Sema4D阳性表达率为71.6%，明显高于正常肺组织（阳性表达率10.0%），且Sema4D表达与组织学分级、临床分期及淋巴结转移密切相关［12］。因此，Sema4D有可能成为抗NSCLC的新靶点和预后的新指标。本研究结果表明，TSRT 100 mg·L-1能显著抑制稳定过表达Sema4D的A549细胞Sema4D表达水平，抑制A549细胞增殖，提示TSRT可能通过靶向Sema4D发挥抗NSCLC的作用。

PlxnB1是Sema4D的高亲和力受体，以异源二聚体的形式分布于内皮细胞膜上，其细胞外部分的分子结构与c-Met分子有28%的相似度，在多种恶性肿瘤中呈现高表达，且与预后差相关［13］。IKEYA等［14］报道，在85例结直肠癌组织标本中，Sema4D表达阳性的标本中74.1% PlxnB1表达阳性，二者的阳性表达存在显著相关性，且双阳性组预后更差，复发率更高。XIA等［15］报道，利用RNAi技术下调NSCLC中PlxnB1的表达，发现体外成管能力明显下降，且不能通过增加外源性Sema4D而逆转，说明Sema4D必须与PlxnB1结合才能发挥效应。因此，Sema4D和PlxnB1联合高表达可作为肿瘤恶性程度的双指标。本研究结果表明，过表达Sema4D的A549细胞PlxnB1的表达也相应增高，佐证了二者阳性表达存在相关性，且提示肿瘤细胞的恶性程度增加；而TSRT干预后二者表达均下调，提示TSRT可能通过下调Sema4D和PlxnB1表达，减少Sema4D与PlxnB1结合而发挥抗A549细胞增殖的作用。

c-Met是受体酪氨酸激酶家族中一类独特的亚族，在大多数肿瘤细胞中为过表达状态，并呈现高水平的自体磷酸化。c-Met激酶能够促进肿瘤细胞增殖，调节肿瘤细胞迁移，增加肿瘤细胞的侵袭能力并诱发肿瘤新生血管的生成［16］。Sema4D和PlxnB1结合后活化c-Met的酪氨酸激酶，引起c-Met以及下游的效应物生长因子受体结合蛋白2相关结合蛋白1的磷酸化，继而发生肿瘤生长、血管形成、细胞迁移和侵袭等生物学过程［14］。本研究结果表明，过表达Sema4D的A549细胞中，PlxnB1的表达也相应增加，c-Met表达亦增加，提示肿瘤细胞的恶性程度增加；TSRT干预使Sema4D，PlxnB1和c-Met表达均下调；提示TSRT可能通过Sema4D/PlxnB1/c-Met轴发挥抗A549细胞增殖的作用。

综上所述，TSRT可能通过下调Sema4D表达，减少Sema4D与PlxnB1结合，抑制c-Met信号途径，从而抑制A549细胞增殖，初步阐明TSRT抗NSCLC的作用机制，为其临床应用提供实验依据。