FQ-PCR法联合咽拭子快速培养法在疑似肺炎支原体感染患儿诊断中的应用价值

张美华，徐清芳，黄凯达

(1.驻马店市第一人民医院 检验科，河南 驻马店 463000；2.郑州大学第一附属医院 检验科，河南 郑州 450000)

肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，MP)为常见儿童呼吸道感染病原体，尤以儿童肺炎较为常见。调查显示，社区儿童获得性肺炎10%～30%由MP引发，但MP感染肺炎、其他病原菌感染肺炎临床体征、症状等方面无特异性区别，故诊断难度较大，不利于临床诊疗[1]。MP感染若未及时有效诊治，随病情进展，可引起肺外感染，寻求一种高效的早期诊断方法，对防治MP感染有积极意义。直接检出病原体为MP诊断金标准，然而MP培养、分离条件高，生长缓慢，培养耗时长，故临床应用明显受限[2]。因此，寻求一种快速有效的检测方法，早期明确有无MP感染，对指导临床治疗有重要价值。实时荧光定量聚合酶链反应(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)法、快速培养法为近年来兴起的MP感染诊断方式，可快速测定咽拭子标本中MP-DNA，具有快速、不受病程影响等优势，在MP所致肺炎鉴别中被广泛应用[3]。但单一检测准确度较低，易出现漏诊、误诊现象，会延误病情。基于此，本研究探讨FQ-PCR联合咽拭子快速培养法在疑似MP感染患儿诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年4月至2020年3月就诊于驻马店市第一人民医院的100例疑似MP感染患儿，男63例，女37例，年龄6个月～10岁，平均(5.14±2.23)岁，病程2～13 d，平均(7.46±2.61)d，<1岁23例，1～6岁41例，>6岁36例。患者家属知晓本研究，签署知情同意书。本研究经驻马店市第一人民医院医学伦理委员会审批通过。

1.2 选取标准(1)纳入标准：①就诊时存在不同程度发热、咳嗽症状；②胸部X线显示双肺呈片状阴影；③对大环内酯类抗生素效果好，对头孢、青霉素等抗生素无效；④白细胞计数稍高或正常，血沉多增快。(2)排除标准：①入组前3 d接受大环内酯类药物治疗；②全身感染、药物过敏史；③心、肝、肾功能不全；④免疫缺陷、血液系统疾病。

1.3 标本采集及检测方法采集标本：就诊当天，在无菌条件下由专业儿科护士取患儿咽拭子样本，置于无菌生理盐水，震荡、密封，-20 ℃低温保存待测。检测方法：以FQ-PCR法、快速培养法测定MP，严格根据说明书操作，快速培养法试剂盒购自郑州内瑞特生物技术公司，FQ-PCR法试剂盒购自广州中山大学达安基因公司，仪器为实时荧光定量PCR扩增仪(杭州，博日line gene)。血清学检测：取患儿2 mL静脉血，离心，取上清液，采用间接荧光免疫法测定MP-IgM；单份血清MP-IgM阳性(双份血清MP-IgM滴度增高>4倍)，滴度≥1∶80即可判定为MP感染。

1.4 联合诊断标准阳性：FQ-PCR法、快速培养法诊断结果任一阳性。阴性：二者诊断结果均为阴性。

1.5 观察指标(1)以血清学检测为“金标准”，记录FQ-PCR法、快速培养法及两者联合检测结果。(2)比较快速培养法、FQ-PCR法及联合检测准确度、特异度、灵敏度、阴性预测值、阳性预测值。(3)分析MP-IgM阴性、阳性患儿MP-DNA拷贝数。

2 结果

2.1 检测结果FQ-PCR法、快速培养法及两者联合检测结果见表1。

表1 FQ-PCR法、快速培养法及两者联合检测结果(n)

2.2 诊断效能联合检测特异度、阳性预测值与单一FQ-PCR法检测和快速培养法检测比较，差异无统计学意义(P>0.05)；联合检测灵敏度、准确度、阴性预测值高于单一FQ-PCR法检测和快速培养法检测(P<0.05)。见表2。

表2 FQ-PCR法、快速培养法及两者联合检测诊断效能比较(%)

2.3 MP-DNA拷贝数MP-IgM阴性患儿MP-DNA拷贝数的对数值为(4.08±1.36)mL-1，阳性患儿拷贝数的对数值为(5.81±1.64)mL-1。阳性患儿MP-DNA拷贝数高于阴性患儿(t=5.554，P<0.001)。

3 讨论

MP是一种机体常见的呼吸道感染病原体，可引发多系统损伤。相关研究指出，MP潜伏期也存在传染性，且近年来呈局部流行趋势，严重影响患儿生活质量[4]。细菌性、病毒性呼吸道感染仅根据临床体征难以准确区分，且MP感染患儿对抗生素不敏感，故易延误治疗时间，增加肺外并发症发生风险。早期快速有效的MP感染诊断方式对临床治疗至关重要。

血清学检测为现阶段MP感染主要诊断方式，准确率较高，对临床鉴别MP感染、早期治疗有重要指导价值，但MP-IgM常出现在感染后7 d，有一定的延后性，另外对于免疫缺陷患儿或免疫系统尚未发育完善的新生儿，血清学检测具有明显局限性[5]。快速培养法为近年来新兴的MP直接检测方法，培养液中含快速生长因子、高营养成分，样本中仅有少量病原体就可实现快速繁殖，并于12～24 h得出结果，具有快速、简单、敏感等优势，但其特异度较低[6]。FQ-PCR法为体外扩增特异DNA片段新技术，逐渐被应用于早期MP感染检测，可使极微量核酸片段于短时间内扩增到几百万个拷贝，具有快捷、简便、灵敏度高、特异性强等特点[7]。相较于常规PCR，FQ-PCR法增加可识别扩增产物探针，同时辅以荧光标记，应用计算机扫描产物过程中荧光曲线，换算为DNA拷贝数，可准确定量目标，且操作方便，较短时间即可得到结果，能降低扩增产物污染风险，减少假阳性发生[8]。有研究指出，发病7 d内FQ-PCR法诊断特异度、敏感度可达90%以上，高于血清检测，然而随病程延长，血液检查敏感度会逐渐升高，因此FQ-PCR法更适合早期快速诊断[9]。另有报道指出，FQ-PCR法、快速培养法在MP感染检测中均有一定误差，但二者检测机制不同，联合应用可起互补作用，能取长补短，互相佐证，提高诊断准确性[10]。本研究结果显示，快速培养法联合FQ-PCR法检测灵敏度、准确度、阴性预测值较单一FQ-PCR法检测及快速培养法检测高，可见将咽拭子快速培养法、FQ-PCR法联合应用于疑似MP感染患儿诊断中，可提高灵敏度、准确度、阴性预测值，有助于早期对症治疗，改善预后。

综上，咽拭子快速培养法联合FQ-PCR法在疑似MP感染患儿诊断中具有较高的灵敏度、准确度、阴性预测值，且荧光拷贝数越高对诊断MP感染越有利，可为临床明确MP感染和早期治疗提供依据。