健脾消癌方对结肠癌HCT116细胞迁移、侵袭的影响研究*

简小兰，曾普华，杜佳，何凤姣，李克雄，蒋益兰

1.湖南省中医药研究院附属医院，湖南长沙410006；2.中医肿瘤学湖南省重点实验室，湖南长沙410006；3.湖南中医药大学，湖南长沙410208

结直肠癌（Colorectal cancer）在全球的发病率及死亡率均处于第3位。近年来随着医疗技术的发展，在早期诊断方面有所进展，仍有1/3的患者在确诊时已发现转移［1-2］，5年总体生存率低于50%［3］。引起结直肠癌患者死亡的主要原因——侵袭及转移［4-5］，积极探索复发转移机制并进行阻断是提高结直肠癌患者生存率的关键。大量的临床研究均显示中医药在结直肠癌的综合治疗中发挥重要作用［6-8］。中医药具有抗肿瘤、抗复发转移、调节免疫力、提高生活质量、延长生存期等作用。多年的临证研究证实，健脾消癌方抗结直肠癌术后复发转移具有良好疗效［9-12］，但其机制尚未完全阐明。本研究从癌细胞迁移、侵袭力方面，运用血清药理学方法研究健脾消癌方对结肠癌细胞迁移及侵袭作用的影响，进一步探讨健脾消癌方抗复发转移疗效机制，为临床应用提供科学依据。

1 材料

1.1 动物和细胞株SD大鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，体质量（200±20）g，雌雄各半，合格证号:SYXK（湘）2015-008。人结肠癌细胞株HCT116购买于中国科学院细胞库，编号TCHu 99。

1.2 药物健脾消癌方主要药物是人参10 g，薏苡仁30 g，重楼10 g，半枝莲30 g，郁金15 g，莪术10 g，从湖南省中医药研究院附属医院中药房购买。取上述2倍量药物，用水浸泡1 h，水量超出药物3～5 cm，大火煮沸后转小火煎30 min，过滤，药渣按前法再煎煮2次，将3次药液混匀、过滤，减压浓缩为相当于生药1.5 g·mL-1，4℃保存，1周内用完。

1.3 试剂与仪器胎牛血清（以色列Biological industries公司，批号:1616316）；DMEM培养基（美国Hyclone公司，批号:NZD1131）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号:P0012）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，批号:P0013b）；结晶紫（上海碧云天生物技术有限公司，批号:C0121）；MMP-2（美国Abcam公司，货号:ab92536）；MMP-9（美国Abcam公司，货号:ab228402）；β-actin（美国Abcam 公司，货号:ab6276）；山羊抗兔IgG（康为世纪生物科技有限公司，货号:01325）；山羊抗小鼠IgG（康为世纪生物科技有限公司，货号:50237）。

细胞培养箱（美国Thermo公司）；Hoefer电泳（美国Hoefer公司）；凝胶成像系统（美国Syngene公司）；EIX808U型全自动酶标仪（美国BioTek公司）。

2 方法

2.1 含药血清的制备SD大鼠20只，雌雄各半，随机分成2组，每组10只。实验组按10.8 g·kg-1（相当于70 kg成年人120 g·d-1的等效量）灌胃；对照组以等容积的生理盐水灌胃。每天灌胃1次，连续7 d，第7天灌胃1 h后，10%水合氯醛（0.3 mL·100 g-1）腹腔麻醉，腹主动脉采血，血液4℃保存，24 h内离心，收集合并同组动物血清，微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌，保存于-20℃冰箱。

2.2 细胞培养HCT116细胞培养于含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM 高糖培养液中，置于37℃，5%的CO2细胞培养箱中培养。细胞长满培养皿底约90%时，进行细胞传代，更换培养液，传代比率为1∶2或1∶3。需要进行实验处理时，取汇合率为80%的对数期细胞。

2.3 细胞划痕实验取对数生长期HCT116细胞，调整细胞密度为5×105mL-1，按每孔2 mL接种于6孔板中，待细胞长满后，吸弃培养液，将一张事先画有直线的纸放于6孔板下，各直线间隔适中，用100μL枪头沿直线划痕，每孔3条，PBS沿壁轻轻冲洗细胞3遍，吸弃PBS，分别加入浓度为10%、15%、20%的含药血清培养液2 mL，10%、15%、20%的鼠对照血清培养液2 mL，及10%胎牛血清为阴性对照组，每组设置3个复孔，培养24 h、48 h后取出培养板，有脱落细胞影响观察则予以更换培养液，倒置显微镜（×50）任意选取5个不同视野拍照，测量划痕的距离。

2.4 Transwell检测细胞迁移、侵袭能力侵袭实验选用Transwell小室（孔径8μm），首先制备含Matrigel胶的Transwell小室。取对数期生长HCT116细胞，调整细胞密度为5×105mL-1，接种于6孔板，分别以10%、15%、20%含药血清和10%、15%、20%鼠对照血清，10%胎牛血清处理细胞。24 h后收集细胞，用DMEM高糖培养基重悬细胞均调整密度为2×106mL-1，分别取100μL各组细胞悬液加入Transwell小室上室，24孔板下室加入600μL含15%的胎牛血清（FBS）培养液。培养24 h后，取出小室清洗，4%的多聚甲醇固定15 min，晾干10 min，0.1%结晶紫染色20 min，PBS清洗3遍，33%的醋酸将Transwell膜上细胞洗涤下来，酶标仪570 nm波长读取OD值，计算细胞迁移抑制率。迁移实验除不在小室铺胶外，其余步骤同侵袭实验。

迁移抑制率＝［（胎牛血清对照组平均吸光值-实验组平均吸光值）/胎牛血清对照组平均吸光值］×100%

2.5 Western Blot法检测基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）蛋白的表达以15%的有效浓度处理细胞，15%鼠血清对照组、10%的FBS为阴性对照组，干预48 h，收集细胞，预冷PBS洗细胞3次，加入含有4μL的含PMSF的RIPA缓冲液400μL，冰上裂解30 min，4℃、12 000 g离心15 min，取上清，BCA试剂盒进行蛋白定量，按照比例加入SDS-PAGE蛋白缓冲液，煮沸5 min，立即分装，置-80℃备用。取50μg蛋白上样，SDS-PAGE凝胶电泳后转膜至PVDF膜，封闭，一抗室温孵育4 h、二抗室温孵育2 h，ECL发光，分别检测MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平，β-actin为内参。以Image J软件分析结果。

2.6 数据统计统计分析采用SPSS 19.0软件，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 健脾消癌方对细胞划痕的影响健脾消癌方含药血清处理24 h、48 h后，含药血清划痕距离宽于相同浓度空白血清组。处理24 h，与相同浓度鼠血清对照组相比，10%、15%、20%的含药血清组划痕距离均较明显增宽（P＜0.05）；处理48 h，与相同浓度鼠血清对照组相比，10%、15%、20%的含药血清组划痕距离均较显著增宽（P＜0.01），且浓度越大划痕距离越大。同浓度含药血清，对细胞迁移抑制能力48 h优于24 h。说明健脾消癌方能够抑制HCT116细胞的迁移，其抑制作用与浓度和时间呈正相关。见图1、图2、图3，表1。

图1 含药血清对HCT116细胞划痕距离的影响

图2 对照鼠血清对HCT116细胞划痕距离的影响

图3 胎牛血清对HCT116细胞划痕距离的影响

3.2 健脾消癌方对细胞迁移的影响处理24 h后，与相同浓度鼠血清对照组相比，10%、15%、20%的含药血清细胞迁移抑制率增大（P＜0.05，P＜0.01），且随浓度增加迁移抑制率增大。说明健脾消癌方能够抑制HCT116细胞迁移，与浓度呈正相关。见表2。

3.3 健脾消癌方对细胞侵袭的影响处理24 h后，与相同浓度鼠血清对照组相比，10%、15%、20%的含药血清细胞侵袭抑制率增加（P＜0.05；P＜0.01），且随浓度增加侵袭抑制率增高。说明健脾消癌方能够抑制HCT116细胞侵袭，与浓度呈正相关。见表3。

表1 含药血清对HCT116细胞迁移距离的影响（n＝3×5，±s）

表1 含药血清对HCT116细胞迁移距离的影响（n＝3×5，±s）

注：与胎牛血清组比较，*P＜0.05，△P＜0.01；与相同浓度对照组比较，#P＜0.05，▲P＜0.01；含药血清48 h与24 h比较，○P＜0.05

组别0 h（l/cm）24 h（l/cm）48 h（l/cm）10%含药血清组7.11±0.24 4.47±0.32*# 5.10±0.38△▲ 15%含药血清组6.98±0.31 5.04±0.45*# 5.56±0.51△▲20%含药血清组7.10±0.25 5.12±0.37*# 6.03±0.41△▲○10%对照鼠血清组7.22±0.36 3.56±0.39 0.55±0.36*15%对照鼠血清组6.80±0.34 3.20±0.40 0.38±0.30 20%对照鼠血清组6.86±0.25 2.95±0.31 0.15±0.23 10%胎牛血清组7.04±0.23 3.05±0.34 0.10±0.06

表2 健脾消癌方含药血清对细胞迁移的影响（±s，n＝3）

表2 健脾消癌方含药血清对细胞迁移的影响（±s，n＝3）

注：与胎牛血清组比较，*P＜0.05，△P＜0.01；与相同浓度对照组比较，#P＜0.05，▲P＜0.01

/%10%含药血清组2.21±0.15*组别OD值迁移抑制率21.9 15%含药血清组2.17±0.23*#23.3 20%含药血清组1.39±0.25△▲50.9 10%对照鼠血清组2.52±0.26 10.9 15%对照鼠血清组2.60±0.14 8.1 20%对照鼠血清组2.81±0.20 0.7 10%胎牛血清组2.83±0.18/

表3 健脾消癌方含药血清对细胞侵袭的影响（±s，n＝3）

表3 健脾消癌方含药血清对细胞侵袭的影响（±s，n＝3）

注：与胎牛血清组比较，*P＜0.05，△P＜0.01；与相同浓度对照组比较，#P＜0.05，▲P＜0.01

/%10%含药血清组0.79±0.14*组别OD值侵袭抑制率25.5 15%含药血清组0.66±0.12△#37.7 20%含药血清组0.54±0.15△▲49.1 10%对照鼠血清组0.94±0.11 11.3 15%对照鼠血清组0.97±0.13 8.5 20%对照鼠血清组1.02±0.10 3.8 10%胎牛血清组1.06±0.09/

3.4 健脾消癌方对MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响与15%鼠血清对照组比较，15%的含药血清细胞的MMP-2、MMP-9蛋白表达显著下调（P＜0.01）。说明健脾消癌方能够下调MMP-2、MMP-9蛋白表达。见表4，图4。

表4 MMP-2、MMP-9蛋白相对表达水平（±s，n＝3）

表4 MMP-2、MMP-9蛋白相对表达水平（±s，n＝3）

注：与胎牛血清组比较，△P＜0.01；与相同浓度对照组比较，▲P＜0.01

-actin 15%含药血清组0.58±0.04△▲0.34±0.02组别MMP-2/β-actin MMP-9/β△▲15%对照鼠血清组1.06±0.02 0.58±0.03△10%胎牛血清组1.11±0.03 0.72±0.02

图4 MMP-2、MMP-9蛋白表达水平

4 讨论

大肠癌属于中医学“肠覃”“肠癖”“脏毒”“癥瘕”“锁肛痔”等范畴。我院肿瘤中心长期从事中医药抗结直肠癌复发转移临床及基础研究，总结肠癌基本病机为“脾虚、瘀积、癌毒”，当以健脾益气，化瘀解毒为治疗法则。拟定健脾消癌方，主要药物组成有人参、薏苡仁健脾益气，郁金、莪术活血化瘀，重楼、半枝莲清热解毒，全方配伍，寒温并用，标本兼顾，攻补兼施。

转移是引起肿瘤患者死亡的主要原因［13］。肿瘤细胞的黏附、迁移能力与癌转移密切相关。单个肿瘤细胞从原发肿瘤脱落游离是肿瘤侵袭转移的第一步，肿瘤细胞与细胞之间黏附因子的损失是肿瘤细胞脱离的要素。脱落的肿瘤细胞即为循环肿瘤细胞，与脉管内皮细胞及细胞外基质细胞黏附，迁移到特定的组织器官，并发展成为继发癌灶的过程，即是转移。迁移是肿瘤细胞转移过程中必不可缺的环节之一［14］。故抑制肿瘤细胞转移的关键之一乃是抑制肿瘤细胞向外迁移。

MMPs是一类高度保守的锌原子依赖内肽酶家族，大部分成员具有降解细胞基膜及细胞外基质功能，是肿瘤细胞转移过程中的重要分子。MMPs在肿瘤转移的多个步骤均有参与，包括肿瘤的迁移、侵袭、免疫逃逸、血管的生成、肿瘤的生长［13］。MMP-2和MMP-9是MMPs的明胶酶组成员，通过降解基底膜的胶原成分、细胞外基质和细胞黏附分子，促进血管生成和调节细胞黏附，从而导致癌细胞运动性增强，促进癌细胞侵袭和转移［15-17］。端传友［18］检测86例结肠癌组织及正常结肠组织中MMP-2、MMP-9的表达，发现结肠癌组织中MMP-2、MMP-9表达水平及阳性率均显著高于正常结肠组织，其中有淋巴结转移的结肠癌组织中MMP-2、MMP-9阳性表达率高于无淋巴结转移者，提示MMP-2、MMP-9高表达与肿瘤转移密切相关。故通过降低MMP-2及MMP-9的表达，可以抑制肿瘤细胞的脱落、迁移，从而降低转移率。

本研究结果发现，健脾消癌方能够抑制细胞迁移及侵袭，并下调MMP-2、MMP-9蛋白表达水平，健脾消癌方抗复发转移机制可能是通过下调MMP-2、MMP-9蛋白表达，从而抑制HCT116细胞迁移、侵袭力。