基于网络药理学探讨鼻咽解毒胶囊治疗鼻咽癌的作用机制

唐 锋，高元峰，任香怡，欧阳婷，黎 旭

(湖南中医药大学 第一附属医院，湖南 长沙 410007)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种发生在鼻咽部上皮组织的恶性肿瘤，发病率居耳鼻咽喉恶性肿瘤之首[1]。鼻咽癌与EB病毒感染密切相关，遗传、化学致癌、环境饮食等因素与鼻咽癌的发生有明显相关性[2]。放射治疗是无远处转移的NPC患者首要治疗方法，局部进展期则采取放疗和化疗综合治疗[3]。但放疗和化疗综合治疗后通常发生腺体萎缩、放射性脑损伤、骨髓抑制、肝肾毒性等不良反应[4]。现代中医认为鼻咽癌的发生内则正气虚弱，脏腑功能失调；外则是邪毒乘虚而入，内外相互影响，逐渐结聚而成癌肿[5 ]。临床实践证明，以放化疗为主，中药治疗作为辅助的综合治疗方案，可以一定程度上改善鼻咽癌患者的预后，提高5年生存率[6，7]。鼻咽解毒胶囊由黄芪、黄连、黄芩、白花蛇舌草、甘草5味中药组成，是湖南中医药大学第一附属医院院内制剂，具有清热解毒，扶正培本之功效，可以用于鼻咽炎、鼻咽癌及EB病毒阳性的鼻咽癌治疗。鼻咽解毒胶囊已有文献报道主要集中在化学成分及质量控制方法的研究[8-9]。研究表明：黄芪多糖、黄芩中的黄芩素和汉黄芩素均可抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖[10-12]；黄连中的黄连素和甘草中的甘草素对鼻咽癌CNE-2细胞有放疗增敏作用[13，14]；白花蛇舌草水提物对鼻咽癌细胞株CNE-1有放疗增敏作用[15]。然而，由于中药复方化学成分的复杂性，使得鼻咽解毒胶囊抗鼻咽癌的作用机制并不明确。中药方剂是按照“君、臣、佐、使”进行组分配伍，通过多味中药的配合实现对机体紊乱状态的调节。中医药治疗疾病的特色是中药复方对复杂疾病的辨证论治，强调整体性。网络药理学作为一门新兴学科，与中药复方“多成分、多途径、多靶点”协同作用的理念相吻合，已被广泛用于中药靶点的预测及作用机制的研究[16-18]。本文运用网络药理学方法探讨鼻咽解毒胶囊治疗鼻咽癌的活性成分、作用靶点，并阐释其作用机制，为进一步实验及临床研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 活性成分收集与筛选

中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)[19]通过整合药效学、药物动力学、靶标预测以及网络系统分析等方法和数据，提供了一个系统层面的视角来研究中药复杂成分的潜在生物学机制。将黄芪、黄连、黄芩、白花蛇舌草、甘草5种中药分别输入TCMSP 数据库进行成分检索，通过查阅相关文献并以口服生物利用度(OB)值≥ 30%药物相似性(DL)值≥ 0.18作为筛选条件，得到鼻咽解毒胶囊的活性成分。

1.2 活性成分靶点预测

TCMSP平台利用SysDT药物-靶标预测模型[20]预测活性化合物靶点，通过TCMSP平台寻找候选化合物相关的潜在靶点，并根据得到的潜在靶点在TCMSP平台中找出相关的疾病，将候选化合物与其潜在的靶点、潜在靶点对应疾病进行整理。并利用UniProt(http://www.uniprot.org)数据库中的Uni-ProtKB搜索功能对不同来源的靶点进行检索，设置背景为Homo sapiens，得到所有靶点的official gene symbol，用于后续分析。

1.3 网络的构建与分析使用

Cytoscape3.6.1软件(http://www.cytoscape.org/)对候选化合物-潜在靶点和潜在靶点-疾病网络进行构建。网络图中的节点分别为化学成分、潜在靶点、相应疾病。化学成分与潜在靶点或潜在靶点与相应疾病之间有相互作用关系的以边相连。使用Cytoscape3.6.1 软件中Network Analysis插件对相应网络进行拓扑性质分析。

1.4 靶点的通路分析

为了进一步了解上述筛选出的靶标蛋白基因(Degree≥5)的功能以及在信号通路中的作用，将筛选得到的作用靶点导入DAVID6.8 数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)，通过输入靶基因名称列表并限定物种为Homo sapiens，将所有靶基因名称校正为其官方名称(official gene symbol)，经上述数据库检索和转化操作，设定阈值P<0.05，进行GO生物学过程富集分析和KEGG信号通路富集分析，选取前20个KEGG富集条目通过Omishare平台(http://www.omicshare.com/tools/index.php/)进行可视化处理。

2 结果

2.1 活性化合物的筛选

通过TCMSP共收集了鼻咽解毒胶囊中化合物1190个，其中黄连96个、黄芪174个、黄芩286个、白花蛇舌草74个、甘草560个。以OB≥30%和DL≥0.18并结合文献报道的活性化合物进行分析，共筛选出33个活性化合物。表1为33个活性化合物基本信息。

表1 鼻咽解毒胶囊中33个活性化合物基本信息

2.2 化合物-靶点网络构建与分析

通过TCMSP平台寻找与33个候选化合物相关的潜在靶点，有6个活性成分未收录与之对应的靶点，故针对有相应靶点的27个活性成分，通过Cytoscape3.6.1软件绘制出活性成分-靶点相互作用网络图(图1)。化合物-靶点网络共包括158个节点(27个化合物节点和131个靶点节点)和275条边，其中绿色节点表示化合物，红色节点表示靶点，每条边表示化合物与靶点之间的相互作用关系。在网络中，一个节点的度(Degree)表示网络中和节点相连的路线的条数。根据网络的拓扑学性质筛选Degree较大的节点进行分析，这些节点在整个网络中起到枢纽的作用，可能是关键的化合物或靶点。表2和表3列出了化合物-靶点网络中关键的化合物和靶点的Degree。该网络中，每个化合物的平均靶点数目为11个，每个靶点平均与3个化合物相互作用。网络中存在一个化合物与多个靶点之间的相互作用，同时也存在不同化合物共同作用于同一个靶点的现象，体现了鼻咽解毒胶囊多成分-多靶点作用的机制。对于化合物，槲皮素(M98)的连接度最高，能与87个靶点蛋白发生相互作用；其次山奈酚(M422)作用靶点55个；另外芒柄花黄素(M392)、Shinpterocarpin(M4891)、汉黄芩素(M173)都能与36个靶点蛋白发生相互作用。对于靶点，Degree最高的为雌激素受体(NR3C4)对应了25个化合物，其次是雌激素受体蛋白(ESR1)、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)、原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Pim-1(PIM1)及细胞周期素A2(CCNA2)均对应了23个化合物。另外过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)和诱导型一氧化氮合酶(NOS2)均对应了22个化合物。

图1 鼻咽解毒胶囊化合物-靶点网络

表2 化合物-靶点网络的关键化合物节点

表3 化合物-靶点网络的关键靶标节点

2.3 鼻咽解毒胶囊靶点-疾病相互作用网络

选取化合物-靶点网络中选取Degree≥5的靶点构建靶点-疾病网络。该网络由201个节点组成，包括31个靶点节点，170个疾病节点和341条边，其中红色节点表示靶点，蓝色节点表示疾病，每条边则表示靶点与疾病之间的相互作用关系(图2)。39个靶点中有 8个靶点在靶点-疾病网络中没有相对应的疾病，推测鼻咽解毒胶囊复方中还存在暂时未被发现的作用途径。该网络中靶点和疾病表现出复杂的相互作用模式，这进一步体现出中药复方多靶点-多疾病的复杂作用模式。该网络包含的疾病根据Degree由大到小分别为肿瘤(Neoplasms)，心血管疾病(Cardiovascular disease)，神经系统疾病Nervous System Diseases)，呼吸道疾病(Respiratory tract diseases)等。由此推测鼻咽解毒胶囊可能在这些疾病的治疗过程中发挥一定的作用。

图2 鼻咽解毒胶囊靶点-疾病网络

2.4 GO生物功能富集分析

采用DAVID 6.8数据库对Degree≥5潜在作用靶点进行GO基因本体分类富集分析，确定了160个GO条目。其中，生物学过程(BP)相关的条目最多，有100个，主要涉及RNA聚合酶II启动子转录的调控、对药物的反应、肽基丝氨酸磷酸化、血管生成、氧化还原过程等；分子功能(MF)相关的条目43个，主要涉及蛋白结合、酶结合、蛋白质均聚活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、ATP结合等；细胞组成(CC)相关的条目17个，主要涉及细胞核、质膜、胞浆、细胞质、核质等；前20条富集结果见表2。结果提示与鼻咽解毒胶囊治疗鼻咽癌相关的关键靶标可能与蛋白结合、细胞核、质膜、胞浆、细胞质、核质、酶结合等生物功能有一定关系。

表4 前20条GO生物功能分析

2.5 KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8数据库对Degree≥5潜在作用靶点进行KEGG通路富集分析，共获得45条富集结果。限定P<0.05，前20条KEGG代谢通路及其相关信息见图3。前20条通路主要包括肺小细胞癌通路(Small cell lung cancer)、癌症通路(Pathways in cancer)、病毒致癌(Viral carcinogenesis)、结直肠癌(Colorectal cancer)、前列腺癌(Prostate cancer)等肿瘤疾病通路；EB病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、血管内皮生长因子信号通路(VEGF signaling pathway)等与鼻咽癌密切相关的信号通路。另外还包括雌激素信号途径(Estrogen signaling pathway)、甲状腺激素信号途径(Thyroid hormone signaling pathway)、催乳素信号途径(Prolactin signaling pathway)等与内分泌系统相关的信号通路；T细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway)等与免疫系统相关的通路。鼻咽解毒胶囊的有效成分可能通过作用于这些通路协同发挥治疗鼻咽癌的作用。

图3 鼻咽解毒胶囊治疗鼻咽癌KEGG通路富集分析

3 讨论

鼻咽癌多被认为因火毒或风热所致，临床治疗强调清热解毒。鼻咽癌放、化疗后常见证型虽包括阴津耗伤、脾胃失调及气血亏虚等，但阴津耗伤是伤阴，脾胃失调为伤气，最终都会导致气血亏虚显示为虚弱体质，所以在清热解毒的同时，应重视疏肝解郁、行气活血，又要强调补益气血以培补元气。鼻咽解毒胶囊方中黄芪具有补气升阳、益卫固表等功效，可补益中气，振兴运化。黄连、黄芩、白花蛇舌草均苦寒，能清热解毒，治疗痈肿疮毒。甘草具有补脾益气、缓急止痛、清热解毒、调和诸药等功效，与黄芪同用益气升阳，同时可增强黄芪、黄芩、白花蛇舌草之清热解毒的功效。全方扶正祛邪，改善患者气虚体质，同时解毒养阴，起到平和抗癌的作用。

本研究采用网络药理学方法研究鼻咽解毒胶囊中5味中药的有效成分并预测潜在靶点，同时构建了化合物-靶点网络，从系统水平分析化合物与靶点相互作用关系。根据化合物-靶点网络分析，度值排名前15的化合物有10个与抗鼻咽癌密切相关。研究表明，槲皮素能通过caspase-3途径抑制人鼻咽癌HEN1细胞增殖，诱导细胞凋亡，并具有细胞周期特异性[21]。另外槲皮素还可通过下调Bcl-2蛋白表达，促进人鼻咽癌CNE2细胞凋亡[22]；山奈酚可以促进细胞凋亡并抑制肿瘤细胞增殖，其机制与降低抗凋亡蛋白Bcl2和增加促凋亡蛋白Bax的表达相关[23]。另外，山奈酚在体内和体外均能抑制血管内皮生长因子分泌，从而抑制血管生成达到抗肿瘤的效果[24]；芒柄花黄素可能通过上调BAX/Bc l-2和下调p-Akt/Akt诱导人鼻咽癌细胞株HONE1凋亡[25]；此外，黄芩素[11]、汉黄芩素[12]、异甘草素、小檗碱、熊果酸、白杨素、毛蕊异黄酮等化合物也有抗鼻咽癌的作用[26-30]。由此推测槲皮素、山奈酚、芒柄花黄素、汉黄芩素、黄芩素等黄酮成分为主要有效成分。另外Shinpterocarpin、千层纸素、巴马亭、药根碱、齐墩果酸与鼻咽癌相关报道较少，有待进一步研究。化合物-靶点网络中NR3C4、ESR1、PTGS2、PIM1、PPARG、NOS2等处于网络的中心位置，可能为鼻咽解毒胶囊抗鼻咽癌重要的靶点。ESR1基因SNP rs9322354位点多态性与鼻咽癌存在显著的相关性[31]。PTGS2作为一个血管生成促进因子及一种潜在的癌基因，在乳腺癌、小细胞肺癌等及鼻咽癌在内多种头颈部恶性肿瘤中表达上调，在鼻咽癌中，EB病毒的癌蛋白LMP1可通过NFKB介导PTGS2的表达，从而使VEGF的表达增高，最后达到血管生成[32]。而PTGS2抑制剂也被证明能减少鼻咽癌血管生成[33]。癌基因PIM-1通过调控mir-17-5p的表达，可以调控鼻咽癌肿瘤细胞的转移[34]。PPARG参与控制单核细胞分化成熟、诱导巨噬细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化和凋亡、抑制炎性反应、抑制肿瘤血管生成等过程。近年来对PPARG的研究主要集中于肿瘤细胞分化、凋亡、抑制肿瘤细胞浸润、抑制炎性反应等生理病理过程[35]。诱导型一氧化氮合酶(NOS2)在鼻咽癌组织中呈高表达，并与淋巴结转移和T分期密切关联，提示其过度表达与鼻咽癌的发生、发展、浸润和转移密切相关[36]。推测鼻咽解毒胶囊可能通过作用于ESR1、PTGS2、PIM1、PPARG、NOS2等靶点发挥抗鼻咽癌作用。另外NR3C4与鼻咽癌相关报道较少，有待进一步研究。KEGG通路富集分析发现，鼻咽解毒胶囊潜在作用通路直接影响多种肿瘤疾病，也有间接影响内分泌系统、免疫系统、信号转导系统等多条与肿瘤形成发展相关的途径。鼻咽解毒胶囊中多种化学成分可与多个靶点相互作用，并通过多种信号途径起作用，反映出中药多成分、多靶点、多途径和整体调节的特点。然而，本研究仅从网络药理学角度探讨了鼻咽解毒胶囊有效成分治疗鼻咽癌作用机制，其具体临床机制尚不明确。因此，本课题组后期将通过实验对预测的结果进行验证和深入研究。