从5-HT1A、5-HT2A后信号通路探讨针刺治疗PCPA失眠机制

罗本华,庞宇舟,张玲,吴椋冰,何疆,李文康,李玉秋

(广西中医药大学 针灸推拿学院， 广西 南宁 530001)

0 引言

5羟色胺1A受体(serotonin 1A receptor，5-HT1A)和5羟色胺2A受体(serotonin 2A receptor，5-HT2A)是与睡眠和觉醒密切相关的经典中枢5羟色胺(serotonin，5-HT)神经递质的2个受体亚型，5-HT1A偶联Gi/o降低腺苷酸环化酶(Adenylate cyclase, AC)活性，减少环一磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate, cAMP)量，影响大脑调节情绪、唤醒等功能。通常5-HT1A激动能缓解焦虑、增加浅深睡眠，5-HT2A偶联G2q/11，激活磷酯酶C(Phospholipase C, PLC)，激动5-HT2A可抑制漫波睡眠、引起觉醒增加。当前，5-HT1A及5-HT2A受体拮抗剂也是睡眠失常和睡眠相关病症治疗的一线药物[1-3]；这两个受体在睡眠调节中起作用，其与中枢5-HT促眠机制有一定关系，但二者是否相关不甚清楚。针刺脐内环合失眠穴是临床失眠症的有效疗法[4]，具有改善对氯苯丙氨酸(p-chlorophenylalanine, PCPA)失眠大鼠神经行为学以及改善中枢5-HT递质障碍机制和5-HT1A(5-HT2A)受体机制等实验基础[5]，本研究旨在探讨5-HT1A和5-HT2A后信号通路对失眠中枢5-HT障碍机制改善的可能作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 动物

80只SPF级雄性SD大鼠，体重(250±15)g，均购自广西医科大学动物实验中心；室内20～25 ℃，昼夜循环采光，饮水不限，喂食定时，预养15 d。

1.1.2 试剂

实验PCPA试剂(批号：H30Y014；Alfa Aesar)；Ⅰ抗Gαq/11/14(Santa cruz，货号：Sc-365906 )、Gαi/o(CST，货号：5290S )、GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 甘油醛-3-磷酸脱氢酶；Bioswamp，货号：PAB36269)，Ⅱ抗：Goat anti-Mouse IgG (Bioswamp，货号：SAB43714 )；大鼠5-HT、cAMP、PLCβELISA试剂盒(均Bioswamp)，武汉基因美生物科技有限公司，批号：GR-201912、201907、RA20590。

1.1.3 仪器

SIGMA3-18K型低温高速离心机(德国Sigma)；Bio-Tek 800酶标仪；Thermo洗板机；BIO-RAD电泳仪；电动匀浆仪；培养箱。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组

从80只正常SD大鼠中随机抽出16只作为正常组，剩下64只经腹腔注射PCPA溶液，制作PCPA失眠大鼠模型，筛选造模成功的48只失眠模型大鼠，按随机数字表法均分至针刺组、模型组、非穴组，各组16只。各组动物按分组随机号顺序编为1～16号；在各自干预完成后，每组取1～6号动物进行免疫印迹检测，每组其余7～16号动物再进行酶联免疫检测及各组相应指标间统计相关分析。

1.2.2 PCPA失眠模型制作

PCPA临用前按大鼠45 mg/(1 ml·100 g)用量，用弱碱性生理盐水(pH7～8)配置成混悬液备用。

按文献[4]采用“腹腔注射PCPA法”制作PCPA失眠模型，并筛选模型。

正常组按每 “1 ml/100 g大鼠体重”腹腔注射弱碱性0.9 %NS溶液。

1.2.3 实验干预处理及疗程

4组按相应干预方法进行实验。

1) 正常组和模型组：均给予与针刺组相同时间及强度的抓摸刺激干预(7 min)，无其他治疗。

2) 针刺组：按脐内环穴加失眠穴方针刺方法干预。

① 先予脐内环穴针刺干预。

取穴：脐内环穴，针刺心肝脾肺肾五脏穴点。脐内环穴参照“十五”规划教材《实验针灸学》大鼠神阙穴定位(P328)及神阙至中脘20 mm折算”相应定位，即是神阙旁开2.5 mm处一条圆环线；其中，正左是脾胃，正右是肝，正上为心，正下为肾，左上方及右上方是肺，共6点。

针刺方法：采用0.25 mm×25 mm毫针，以10°～15°由内向外刺2～4 mm深，不行针刺手法，留针30 s出针，共需3 min。

② 再予失眠方穴针刺干预。

取穴：支沟双、神门双、足三里双、三阴交双。大鼠支沟穴定位前肢外侧，距腕关节4.5 mm左右的尺桡骨间，直刺1 mm；神门在前肢内侧腕部横纹尺骨边缘，直刺1 mm；足三里在膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处，直刺7 mm；三阴交在后肢内踝尖直上10 mm，直刺5 mm。

针刺方法：采用0.25 mm×25 mm毫针，刺入穴位规定深度，施90°以内、频率90～180次/min的小幅度高频捻转手法30 s出针，操作共需4 min。

该针刺组每次治疗共7 min。

3) 非穴组： 非穴点按文献[4]取两肋下的固定点[4]及刺法，每点行针120 s后留90 s即出针，双穴共7 min。

4组均按以上各自干预方案，1次/d，总6次。

1.2.4 实验动物海马取材

实验干预完成后次日，断头处死实验大鼠，开颅取出全脑，冰上分离海马组织，冷0.9 %NS溶液洗净血液，电子称称重后，-80 ℃冰箱保存备检。

1.2.5 5-HT、cAMP、PLCβ含量检测

按文献[4]，采用“双抗体夹心法”检测大鼠海马组织中5-HT、cAMP、PLCβ含量。

1.2.6 大鼠海马Gαi/o、Gαq/11/14表达检测

主要步骤：①提取总蛋白：取新鲜海马组织称量，加适量蛋白酶抑制剂和蛋白裂解液，置冰水混和物中电动研磨并匀浆，12 000转，4 ℃离心，收集上清液，分装，-80 ℃保存；②BCA法蛋白定量；③蛋白电泳；④转膜；⑤封闭；⑥一抗孵育；⑦二抗孵育；⑧显定影。应用Quantity One软件计算各组目标蛋白条带的灰度值，并与同一膜上相应同组GAPDH 条带的灰度值进行比较，就该蛋白比值统计组间差异。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 对PCPA大鼠海马5-HT、PLCβ、cAMP含量的影响，如表1。

表1 各组大鼠海马5-HT、PLCβ、cAMP含量的影响Tab.1 The contents of 5-HT, PLCβ, and cAMP in hippocampus of four group rats (Mean±S.D)

从表1可以看出：与正常组比较，PCPA失眠模型组5-HT、cAMP含量均较显著性降低，而PLCβ含量显著性升高；通过针刺后5-HT、cAMP含量均得以显著升高，PLCβ含量显著降低，均有统计学意义(均P<0.01)，也显示经穴作用的特异性。

2.2 各组5-HT与PLCβ、cAMP指标间的相关性，如表2。

表2 各组大鼠海马5-HT与PLCβ、cAMP指标间相关性表Tab.2 The index correlation between 5-HT and PLCβ, cAMP in hippocampus of rats in each group(Mean ± S.D)

表2可见，各组5-HT与PLCβ之间呈负相关性，5-HT与cAMP之间均呈正相关性，各组均有统计学意义(均P<0.01)。

2.3 对PCPA大鼠海马Gαi/o/GAPDH与Gαq/11/14/GAPDH相对表达的影响，见表3、图1与图2。

表3 各组大鼠海马Gαi/o/GAPDH与Gαq/11/14/GAPDH含量的影响Tab.3 The relative contents of Gαi/o/GAPDH and Gαq/11/14/GAPDH in hippocampus of four group rats

从表3可以看出：PCPA失眠模型组Gαi/o稍有升高，针刺后数据稍有下调，但四组间无统计学意义(P>0.05)；而PCPA失眠模型组Gαq/11/14相对表达明显降低，通过针刺后Gαq/11/14相对表达明显升高，四组间有统计学意义(P<0.05)，未显示经穴作用的特异性。

图1所示为各组PCPA大鼠海马Gαi/o/GAPDH相对表达量，模型组和非穴组较正常组表达要强，灰度深，但组间比较差异无统计学意义。

图1 各组PCPA大鼠海马Gαi/o/GAPDH相对表达Fig.1 The expression of Gαi/o/GAPDH in the hippocampus of the four group rats

图2所示为各组PCPA大鼠海马Gαq/11/14相对表达量，模型组和非穴组较正常组表达明显要弱，灰度浅，组间比较具有统计学意义(P<0.05)。

图2 各组PCPA大鼠海马Gαq/11/14/GAPDH相对表达Fig.2 The expression of Gαq/11/1/GAPDH in the hippocampus of the four group rats

3 讨论

失眠症总病机是“阴阳失衡、水火失调”[6-7]。失眠穴方由“支沟、神门、足三里、三阴交”组成，立意关键是泻火补水，用经也取平衡阴阳之义，是原广西中医药大学肖继芳教授治疗失眠症的针刺验方。脐内环穴位于腹阴侧脐旁开0.5寸，沟通任冲，以诸阴之会任脉神阙为中心，是总的调阴和阳要穴；又为机体三部人部所在，先后天之根，善调节先天后天，结合针向针刺，是调理脏腑信息和气血之枢纽；由于脐通五脏神和气，基本性起到针刺调气调神作用；因而，脐内环穴针刺是壮医针刺的基础调气方法，在全身诸多疾病广泛作为基础调理方法使用，在失眠症壮医临床中也是较具研究基础和临床效验的效方。数年来，笔者验证了脐内环结合失眠穴方针刺治疗失眠症取效极好，明显优于二者单一针刺[4]， 这样能有效地结合脐内环针平衡阴阳、调节脏腑、治神调气的整体作用和失眠穴方肢体经穴调节的远治作用，较切合失眠症的总病机，是以确立其为失眠症的研究方法。

睡眠生理病理基于睡眠-觉醒机制，睡眠障碍与一些中枢神经递质含量发生改变密切相关[8-9]。中枢5-HT对慢波睡眠的发生和维持起着重要作用，是公认的“致眠因子”[10]；海马是参与脑内5-HT睡眠-觉醒机制的重要结构组织之一[11]；PCPA是中枢5-HT合成抑制剂，研究表明，腹腔注射PCPA 能导致大鼠大脑皮质5-HT浓度下降约80 %[12]，导致睡眠昼夜节律消失，达到完全失眠，故PCPA大鼠模型是目前广获认可及经典的失眠症研究动物模型。中枢5-HT促睡眠物质是受细胞功能调节分泌、合成或分解的，机体中5-HT受体亚型由自身5-HT配体直接激活，研究证明PCPA失眠中枢5-HT递质又受细胞内cAMP浓度水平调节的[13]，cAMP又是5-HT1A、5-HT2A受体后信号通路上的下游关键信号分子[14]，推测5-HT亚型受体介导的下游胞内Gα/cAMP、Gα/cGMP/PLC细胞睡眠机制与中枢5-HT递质障碍机制可能存在某些相关性；5-HT1A、5-HT2A均属G蛋白偶联受体，海马中均广泛分布，5-HT1A偶联Gαi/o，降低AC活性，减少cAMP生成，影响大脑调节情绪、唤醒和昼夜节律等功能，但大鼠海马组织中5-HT1A对AC活性具有双重调节作用[15]；5-HT2A偶联Gαq/11，激活PLC，PLCβ(β-Phospholipase C, β型磷酯酶C)是Gαq/11调节的主要亚型，在调节睡眠觉醒中的起重要作用[13]。

研究结果显示，一方面，PCPA失眠大鼠5-HT含量与Gαq/11蛋白表达均显著降低，而PLCβ显著升高，5-HT与PLCβ之间受损程度呈负相关性关系；经过失眠方结合脐内环穴针刺后5-HT、Gαq/11(G蛋白αq/11亚基)含量显著升高，而PLCβ含量显著下降，显示经穴相对特异性，且与PCPA大鼠5-HT的改善程度也呈负相关性，结合前期发现PCPA模型大鼠5-HT2A的蛋白、基因表达均显著降低，该针刺显著下调5-HT2A的蛋白[5]及基因表达的结果，说明PCPA失眠模型大鼠不仅存在中枢5-HT递质障碍机制，也存在5-HT2A/Gαq/11/PLCβ受体后信号通路的受损机制，而该针刺对这二种障碍机制均有良性改善，5-HT2A受体后通路改善则抑制促醒有助于睡眠改善。另一方面，实验中PCPA失眠大鼠cAMP含量显著下降，且5-HT与cAMP之间受损呈正相关性关系，该针刺方法显著升高了cAMP含量，且与PCPA大鼠5-HT受损的改善呈正相关性，而针刺对Gαi/o(G蛋白αi/o亚基)无显著改善作用，诸组间无统计学意义；结合前期检测到PCPA失眠大鼠海马5-HT1A的蛋白及基因表达明显降低，而该针刺有统计意义的升高[5]结果；从5-HT1A受体后信号通路的效应看，PCPA失眠大鼠也存在受体后5-HT1A/Gαi/o/cAMP信号通路受损的机制，该针刺起到了改善这一信号通路损伤机制，与改善PCPA失眠大鼠中枢5-HT递质障碍机制相一致；本实验中，针刺后这一信号通路cAMP生成增加，导致5-HT合成、释放增加，有助于失眠中枢5-HT递质障碍机制的改善，从而改善5-HT1A受体后通路则调节促眠功能。综合二个受体后通路实验说明：PCPA模型大鼠存在中枢5-HT递质信号传递障碍机制，也存在5-HT1A、5-HT2A受体后细胞信号通路的障碍，二种障碍机制间存在某种内在关联性，或形成一定神经环路影响睡眠；而该针法既能改善PCPA大鼠核心的中枢5-HT递质障碍机制，也能调控并改善了受体后5-HT1A/Gαi/o/cAMP、5-HT2A/Gαq/11/PLCβ细胞信号通路的损伤机制，该两个细胞通路机制改善也有助于中枢5-HT递质障碍机制的改善，综合改善了睡眠障碍。