UPLC 法同时测定紫菀中三种绿原酸类物质的含量

王 蓉，李斐然，郭伟娜*，史学礼

（1.安徽省中医药科学院 亳州中医药研究所，安徽 亳州 236800；2. 安徽中医药大学，安徽 合肥 230031；3. 亳州市食品药品检验中心，安徽 亳州 236800）

中药紫菀为菊科植物Aster tataricus L.F.的干燥根和根茎[1]。多生长于潮湿的阴坡、草地、河边、沼泽等地方，海拔400 ～2 000 m，别名：青菀、紫倩、小辫、返魂草[2]。据统计全世界约有250 种，广泛分布于亚洲，北美洲，欧洲，其中中国约有近百种，主要产地有安徽，河北，河南，甘肃，东北，内蒙古，山西，陕西及甘肃南部等地[3]。紫菀在我国有着悠久的应用历史，是中医治疗咳喘的常用中药[4]，临床常切厚片生用或蜜炙后应用[5]。紫菀用途广泛，国内已有三百多年的栽培史，药材资源非常丰富。现代研究表明紫菀中化学成分较多，主要含有三萜及其苷类、甾醇类、蒽醌类、肽类及黄酮类[3-6]。三萜类成分主要有紫菀酮[7]、表木栓醇、木犀草素等，皆有止咳、化痰、平喘的功效。黄酮类成分是抗炎镇痛的主要活性成分之一[8]，山奈酚和槲皮素具有明显的抗氧化作用[9]，并且在抑制溶血和免疫调节方面也有较好的作用[10]。绿原酸具有抗过敏、抗氧化、预防心血管疾病、抗肿瘤、抗菌、促进糖类和脂质代谢等作用。香豆素类物质具有抗HIV、抗炎等多种药理活性[11-12]。此外紫菀尚具抗病毒、利尿等药理作用。

目前紫菀常用的含量测定方法是高效液相色谱法，鲜有超高效液相色谱的报道。超高效液相色谱具有迅速高效的优点，采用超高效液相色谱（UPLC）法建立测定紫菀中绿原酸类物质含量的方法，为紫菀药材的质量控制提供更高效的途径。并采用此方法对紫菀的根、根茎、芽三个不同部位的绿原酸，异绿原酸A，异绿原酸B 的含量进行比较，为紫菀的合理应用提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

电子分析天平（梅特勒托利多，型号XPE26）；Waters Acquity 超高效液相色谱仪，Acquity UPLC BEH C18 色 谱 柱 ；700VED 型 数 控 超 声 清 洗 器（100 W，25 kHz，合肥金尼克机械制造有限公司）；1 mL、5 mL、10 mL 移液管，100 mL 溶量瓶，量筒，德国Brand 公司，均检定为 A 级[13]。

1.2 试药

绿原酸（批号：wkq19010201，四川省维克奇生物科技有限公司）、异绿原酸A（批号：18121001，成都普菲德生物技术有限公司）、异绿原酸B（批号：17121201，成都普菲德生物技术有限公司）。甲醇、乙腈、0.1%磷酸为色谱醇，纯化水等。

实验药材来自亳州不同地区，有亳州市十九里马寨村、谯东区铜关村，经安徽中医药大学方成武教授鉴定为紫菀（Aster tataricus L.f），采挖时间为2019 年3 月17 日。

2 方法

2.1 方法

2.1.1 对照品溶液的配制

分别称取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B 对照品适量，精密称定，分别加甲醇溶解制成每1 mL含绿原酸0.046 30 mg 、异绿原酸A 0.045 41 mg、异绿原酸B 0.014 30 mg 的对照品溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的配制

将新鲜的紫菀药材洗净后进行分类，可得到紫菀根茎、紫菀根、紫菀芽（母根）3 个药用部分，用烘箱进行烘干，粉碎后再过四号筛，可得3 个紫菀根茎、紫菀根、紫菀芽（母根）的样品粉末，取各样品粉末约1 g，精密称定，至具塞的锥形瓶中，精密量取甲醇50 mL，称重，超声处理30 min，放冷后称重，用甲醇补足后摇匀，用0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，得100%甲醇提取供试品溶液。再取各样品粉末约1 g，加80%甲醇50 mL，按上述相同的方法进行操作，即得80%甲醇提取供试品溶液。

2.1.3 色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 mm 50 mm，1.7 μm）；流动相A 为乙腈，B 相为0.1%磷酸，梯度洗脱；检测波长：330 nm；流量：0.20 M/min；柱温：30 ℃ ；进样量：1 μL。色谱图见图1。

图 1 供试品（A）、混合对照品（B）UPLC图

2.2 结果

2.2.1 线性关系的考察

精密量取3 种对照品溶液1、5、10、20、100 mL于100 mL 量瓶中，分别用甲醇稀释至刻度，制得各对照品系列质量浓度，按照2.3 项下色谱条件测定。以绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B 进样量为纵坐标（y），对应峰面积为横坐标（x），分别绘制曲线，得到回归线方程分别为：绿原酸y=0.0002x+4E-15（r=1）、异绿原酸Ay=8E-0.5x+0.0948（r=0.9997）、异绿原酸By=7E-0.5x（r=1）。结果表明绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B 进样量分别在0.463～46.3 mg、0.4541 ～45.41 mg、0.1430 ～14.30 mg 范围内线性关系良好。

2.2.2 精密度试验

精密吸取2.1 项下3 种对照品溶液，按2.3 项下色谱条件采用标准对照法进行测定，重复测定6 次，进样量1 μL。结果绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B 的RSD 值分别为1.09%（n=6）、0.82%（n=6）、1.53%（n=6），结果表明精密度良好。

2.2.3 稳定性试验

取上述供试品溶液，分别于0，3，6，12，24 h测定绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B 的峰面积，进样量1 μL，结果相应3 种成分峰面积的RSD 值分别为1.46%（n=6）、1.28%（n=6）、2.01%（n=6），表明供试品溶液在24 h 内稳定性较好。

2.2.4 重复性试验

取同一批紫菀样品6 份，精密称定，分别按2.2项下的方法制备供试品溶液，按2.3 项下色谱条件采用外标一点法测定，进样量1 μL，结果样品中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B 的平均质量分数分别为0.036 0，0.006 5，0.001 1 ，相对标准偏差分别为1.62%，1.05%，1.00%

2.2.5 加样回收试验

取已知含量的紫菀样品，共6 份，各约1 g，精密称定，分别精密加入绿原酸对照品溶液（4.63 μg/mL）、异绿原酸A 对照品溶液（4.541 μg/mL）、异绿原酸B 对照品溶液（1.430 μg/mL），加入甲醇补足至100 mL，按2.2 项的方法操作，制得供试品溶液，按2.3 项下色谱条件采用标准对照法进行测定，进样量1 μL ，试验测得绿原酸回收率为98.7%（RSD=1.68%）， 异 绿 原 酸A 的 回 收 率 为96.6%（RSD=1.04%），异绿原酸B 的回收率为97.14%（RSD=0.98%）。

2.2.1 紫苑地下不同部位不同浓度甲醇提取液各种绿源酸含量

表1 紫菀地下不同部位、不同浓度甲醇提取液各种绿厚酸含量比较

根据实验结果发现，紫菀根、紫菀根茎、紫菀芽（母根）中，根茎中绿原酸类的含量最高。紫菀根中所含绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B 的量在三者中最低。采用甲醇、80%甲醇溶液分别提取紫菀地下不同部位，运用比较法可以得出，把甲醇作为提取溶剂更具有优势。因为提取效率更高，样品干扰少，使得测定结果更加准确和明了。

2.2.7 检测波长的确定

通过对绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B 三种成分紫外吸收曲线的分析比较，可以得出紫菀药材不同部位中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B 均在330nm 左右有较高的紫外可见吸收，使得检测更加方便、检测结果更加准确，各成分色谱峰分离的更加分散，没有集中在一块，实验结果更加明显和突出。

2.2.8 流动相的确定

对多种流动相进行了尝试，其中包括甲醇-磷酸溶液、甲醇-甲酸溶液、乙腈-磷酸溶液、乙腈-甲酸溶液等流动相系统。实验发现以乙腈-磷酸溶液流动相，可以使绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B 各成分的峰形和分离度良好，最终选择乙腈-磷酸溶液为流动相。

2.2.9 提取溶剂与提取方法的确定

此次试验分别采用80%甲醇、100%甲醇溶液配制供试品溶液。并对超声提取与加热回流两种提取方法进行了考察，经过测定之后得出，用100%甲醇配制的供试品溶液中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B 的含量比用80%甲醇配制的供试品溶液的含量高。实验还发现不同提取方法对所测含量的影响不大，但超声提取相对简单、方便、快捷、节约时间，因此选用100%甲醇为溶剂超声提取紫菀药材。

2.2.10 浓度的确定

参照图2 的光谱图，各成分的吸光度大致都在0.2 ～0.7 范围之内。所以使用此浓度更加合适，各成分的色谱峰分离度满足色谱系统试验要求。在此浓度下进行实验，使测定的数据更加合理和准确，最终的结论更加具有说服力和可信度。

3 结论

首先建立了超高效液相色谱法（UPLC）同时测定绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B 含量的方法，方法简单方便、快速高效、分离度较好、灵敏度高，而且应用范围广泛，适应性较好，从供试品色谱图中可以看出精密度、稳定性、线性关系、重复性、加样回收率的测定都符合实验要求，各成分的峰形均比较良好，峰面积与浓度成正比例。其次实验测定了紫菀不同地下部位三种绿原酸类物质的含量，发现紫菀地下不同部位绿原酸类物质的含量存在差异，其中紫菀根茎中绿原酸类的含量最高。芽（母根）中绿原酸类物质的总含量介于根与根茎之间，但根据药典芽属于非入药部位。目前未见使用超高效液相色谱法测定紫菀中各成分的含量，超高效液相色谱法为紫菀的质量控制提供了有效的可靠地分析方法，对进一步研究紫菀的各种成分的含量差异，充分发掘其新的药用价值具有一定的意义，期望通过更深入的研究促进紫菀各部位合理使用。