百合病毒检测技术研究进展∗

杨 丹 赵斌安 许 燕 张 琪 吴文静浦心祎 袁文天 赵悦琪 赵恒震 史 斌

（1 上海师范大学生命科学学院 上海 200234 2 同济大学医学院十院临床医学院 上海 200092 3 上海博满生物科技有限公司 上海 201106）

百合，除了可食用、入药外，还因美好寓意备受人们的喜爱。百合科百合属为多年生植物，其繁殖方式主要靠无性繁殖技术——扦插、分球等，这种方式会使感染百合的病毒不断传代，在开放环境下扩散感染其他植株，扩大病毒传播范围，最终对花卉种植业造成严重的经济损失。因此，百合脱毒苗制备和相应病毒检测技术对切断病毒传播、减少经济损失至关重要。

1 百合主要病毒种类及危害

在百合种植过程中，百合斑驳病毒（lily mot‐tle virus，LMoV）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）与百合无症病毒（lily symptomless vi‐rus，LSV）是最易感染百合、危害最大的3 种病毒。百合斑驳病毒和百合无症病毒属于线状植物病毒，传播广、危害大，被我国明令禁止入境，是三类检疫有害生物。黄瓜花叶病毒则造成叶萎缩黄化、变皱、茎变形等病症。然而，上述3 种病毒常伴随出现，导致百合花叶斑驳、花叶变形、植株矮化或无主杆、百合切花或鳞茎品质不合格。

2 病毒形态观察鉴定

病毒粒子的形态结构和寄主病变情况清晰且直观，是植物病毒鉴定和研究的重要依据。百合病毒的光学显微诊断法是在光镜下观察病毒粒子的形态结构和存在状态、寄主细胞的结构变化，以及病毒的复制和装配等过程。随着生命科学、物理学、化学和电子信息学的发展与相互渗透，电子显微镜技术包括负染色法（negative staining）、电 镜 超 薄 切 片 法（electron microscopy ultrathin section）、免 疫 电 镜 法（immuno special electronic microscope，ISEM）、胶体金免疫电镜法（immunogold labeling）等逐渐成为主要研究手段，能提供更多的病毒信息。

梁巧兰等[3]利用负染色和超薄切片技术，在电镜下观察百合病毒和内含体形态、大小并配合间接酶联免疫吸附法（ELISA）鉴定病毒侵染种类。电镜检测技术可直观观测到样品，但需专业实验室，配备电镜等精密昂贵设备及高超娴熟的专业操作技能，因此，不适用田间大量样本检测[4]。

3 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法将植物病毒作为抗原，注射至动物体内产生抗体。每种病毒产生的抗血清具有特异性识别功能，可根据已知病毒的抗血清检测未知病毒。该方法灵敏度较高，但纳克级别以下无法检测，且需制备高质量的抗血清，易出现假阴性。抗原抗体反应具有专一性，但不同百合植株中病毒抗原会有所差异，常会漏检某一病毒或某一株系病毒。此外，病毒感染植株也呈现不均匀分布、病毒分离多样性及季节性差异，这些都会影响酶联免疫的最终结果[5]。

4 分子生物学方法

4.1 PCR、RT-PCR 及多重PCR 技术 以核酸检测为代表的分子生物学检测技术因高特异性、高灵敏度、快速、便捷的特性得到广泛关注并被快速普及。聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction，PCR）：首先将双链DNA 变性解旋成单链，在DNA 聚合酶的参与下，以单链DNA 为模板，特定引物为起点，利用4 种脱氧核苷酸，按照碱基互补配对原则复制成新的DNA，通过变性、退火、延伸等多个循环，实现特定基因的体外放大。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）则是在常规PCR基础上运用逆转录酶，将逆转录与基因扩增在一个反应管内进行。而多重PCR 技术则是在同一反应液中加入多对特定引物对，扩增多段特定DNA 序列的过程。

邹迎春等[6]依据公开的百合斑驳病毒、百合无症病毒序列保守区，分别设计了能扩增出不同大小的目的片段的特异引物对，以18S rRNA 为内参基因，优化多重RT-PCR 反应条件，实现了同时快速检测多种病毒。该体系未检测出其他病毒，特异性好，能分辨出2 种病毒和内参基因。

PCR 技术操作简单、特异性强，但在PCR 检测过程中，假阳性或假阴性结果仍常存在。在RTPCR 检测时，因RNA 病毒逆转录的过程中容易被RNA 酶污染，易出现假阴性。而多重PCR 技术因反应液中存在多对引物对，扩增时引物相互干扰，不同片段扩增效率不同，短片段优先扩增，而且易出现人工片段，出现非特异性扩增，无法判断是否存在假阳性，有时需添加假阳性检测步骤。

4.2 基因芯片 基因芯片又称生物芯片，该技术将序列一致的靶序列的探针固定在支持物表面，再与待测样本中的源核酸杂交，最终，通过测定荧光强度变化，对样品序列信息进行解读和分析，高通量获取相关生物信息[7]。贾慧等[8]根据百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒及另外2 种常见的植物病毒——烟草花叶病毒和马铃薯Y 病毒的外壳蛋白基因，设计引物和寡核苷酸探针，通过芯片杂交反应条件（变性处理、时间、温度）及杂交组分和浓度的不断优化，制备高特异性基因芯片。但基因芯片技术属于综合性的高新技术，不仅需要昂贵的芯片制作系统，还需昂贵的激光共聚焦扫描仪辅助，且对操作人员的专业要求较高，这使得该技术的推广受到了限制[9]。

4.3 环介导等温扩增技术（LAMP） 环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）由日本学者Notomi[10]提出，在恒温条件下（65℃左右），具有链置换特性的Bst DNA 聚合酶的作用下，利用4 条可特异性识别靶基因上的6 个特异区域的引物（F3/B3 和FIP/BIP），可实现目标序列的109～1010倍扩增。

本实验室从百合斑驳病毒、百合无症病毒、黄瓜花叶病毒的CP基因上寻找保守区域，选择保守区域时避开所有的突变位点设计获得LAMP 特异性引物，能识别靶序列上的6 个特异区域。建立的百合病毒的LAMP 和RT-LAMP 方法具有高特异性，与常见侵染百合的多种病毒无交叉，灵敏度高，可在模板纯度只有10 个拷贝数下进行扩增，反应结果通过添加SYBR GreenⅠ染料，肉眼可视，显色为绿色的样品为阳性，含有百合病毒，显色为橘色的样品为阴性，不含百合病毒[11-12]。

LAMP 反应时间短，灵敏度高，受样本质量影响小，可省略DNA 或RNA 纯化步骤[13]。本实验室对现有的环介导等温技术又进一步优化，即实现LAMP 试剂预分装和配套的样本直扩技术，现场只需加样1 次，无需电泳，实验结果用荧光进行显色判断，阳性产物为绿色，阴性产物为橘红色。LAMP 反应检测灵敏度高，最低检测限为2 个拷贝，检测时间为20 min。整个反应只需要金属浴或水浴锅，3 支移液器即可操作，设备简单，总费用6 000 元左右。

LAMP 试剂预分装。在百级净化车间，将试剂分装为2 个部分，A 试剂吹干在管盖上，B 试剂分装在PCR 管中，封装好。由于核酸染料在反应前体系配制时加入，反应后无需开盖添加染料进行显色，避免因开盖产生的气溶胶污染。试剂放置室温可长达7 个月。

样本直扩技术意味着样本进一步处理即可直接加入反应体系，无需进行纯化。固体样品加入裂解液，95℃裂解10 min，上清液即可作为模板，无需纯化。极大简化了样品制备的步骤，减少了劳动强度，也减少了污染的风险。现场操作步骤简单，高中生训练2 h 即可操作。然而，LAMP 检测方法也具有一定的局限性：靶序列要求较长，低于100 bp 无法设计引物。

5 不同测定方法的比较

目前，常用的百合病毒检测方法虽多，但不同的方法会因植物病毒和寄主的不同而有不同的效果。虽然电镜观察法较直观，但其需高倍数的电子显微镜，且样品的制备费用昂贵。免疫学方法较为复杂，对实验人员的操作能力要求较高，且实验需制备大量的高质量的抗血清，成本高，不易广泛推行。PCR 和LAMP 扩增时引物结合位点不同，PCR 引物只需与靶序列的上、下游位点结合且引物不完全匹配时，PCR 仍能扩增出片段，但易出现非特异性片段，而LAMP 4 条引物只有与靶序列的6 个区域完全匹配，才能进行有效扩增。与常规PCR 和RT－PCR 相比，LAMP 检测具有特异性和灵敏度更高、用时更短。LAMP 只需在等温条件下完成，用恒温水浴锅就可完成反应，适合在基层和现场快速检测，操作简便，是一项快速、便捷但又准确性高的新技术，具有很广的发展前景。简而言之，自LAMP 技术发展以来，因其操作简单、不需要昂贵仪器设备、快速、高效、特异性好、灵敏度高等优点，更适用于田间样本检测。