PRiME净化-UHPLC-MS/MS法测定鸡蛋中金刚烷胺类药物残留

李占彬，王正强，黄永桥，杨鸿波

贵州省分析测试研究院（贵阳 550014）

金刚烷胺类药物具有饱和三环癸烷的结构，主要有金刚烷胺（Amantadine）、金刚乙胺（Rimantadine）、美金刚（Memantine）等（图1），具有抗流感病毒、抗帕金森氏综合征等药理作用[1-4]。在家禽养殖过程中，金刚烷胺类药物被广泛用于鸡禽流感的预防和早期治疗。随着养殖规模的扩大及流感类疾病的频发，金刚烷胺类药物使用剂量正在日益增加，食用这种有金刚烷胺类药物残留的禽产品，会导致人体对病毒的耐药性增加[5-7]。农业部在2005年发布的农业部第560号公告中明确禁止金刚烷胺类抗病毒药物生产、销售及使用，但在实际养殖过程中，仍存在非法使用该类药物，这已成为我国畜禽产品安全的重要影响因素，因此亟需建立一种快速检测该类药物残留的检测方法。

目前已报道的金刚烷胺类药物检测的方法主要有高效液相色谱法[8-10]、高效液相色谱-串联质谱法[11-14]、气相色谱法[15-17]，这些方法测定的基质各异。其中，汤晓艳等[5]建立的鸡蛋中金刚烷胺残留测定方法中，样品处理过程繁琐、耗时长、使用大量有试剂，且方法检出限较大，难以满足快速分析的需要；林涛等[19]和吴银良等[18]建立的鸡蛋中金刚烷胺类药物残留量的测定方法，样品前处理使用QuCHERS试剂进行净化，该方法虽然简单快速，但其去除干扰物质的能力较SPE柱略差，对结果的准确性有一定影响。

此次试验的样品前处理使用PRiME HLB进行净化，前处理简单，并且基质干扰较小、灵敏度较高，能得到较为满意的效果。通过优化UHPLC-MS/MS条件，并对鸡蛋样品进行测定，建立了同时测定3种金刚烷胺类药物的快速检验方法，并采用同位素内标法进行定量分析。该方法具有操作简单、快速、定性定量准确等优点，适用于鸡蛋中金刚烷胺类药物的测定，为金刚烷胺类药物的检测提供更多的技术选择。

图1 3种物质的化学结构式

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 主要仪器与设备

Agilent 1290超高效液相色谱仪、Agilent 6470 QQQ三重串联四极杆质谱，配有ESI源（美国Agilent公司）；Blixer3搅拌机（法国ROBOT COUPA公司）；LT2002电子天平（常熟市天量仪器有限公司）；UMV-2多管涡旋混合器（北京普立泰科仪器有限公司）；离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）；Supelco 12管固相萃取装置（美国Supelco公司）；氮吹仪（上海安普实验科技股份有限公司）；陶瓷均质子（迪马科技有限公司）；Oasis PRiME HLB固相萃取小柱（美国Waters公司）；0.22 μm PTFE滤膜（上海安普实验科技股份有限公司）。

1.1.2 主要材料与试剂

金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚、金刚烷胺-D6、美金刚-D6（纯度＞98%，德国Dr. Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；乙腈（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲酸（色谱纯，上海安普实验科技股份有限公司）；乙酸铵（分析纯、西亚试剂）。

1.2 标准溶液配制

分别精密称取10 mg（精确至0.000 1 g）金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚、金刚烷胺-D6、美金刚-D6标准品于100.0 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，混匀，配制成质量浓度为100 mg/L标准储备液，于-18 ℃避光保存。分别从金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚标准储备液中移取100.0 μL标准储备液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 mg/L的混合标准中间液；移取100.0 μL混合标准中间液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成10 μg/L的混合标准工作液；备用。分别从金刚烷胺-D6、美金刚-D6标准储备液中移取100.0 μL标准储备液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 mg/L的混合内标中间液；移取500.0 μL混合标准中间液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成50 μg/L的混合内标工作液；备用。

1.3 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18反向色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：乙腈；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样体积：2.0 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 洗脱梯度

1.4 质谱条件

离子源，电喷雾离子源（ESI），正离子扫描；多反应监测（MRM）；毛细管电压，4.5 kV；雾化器压力，40 psi；干燥气流速，10 L/min；干燥气温度，300 ℃；鞘气流速，10 L/min；鞘气温度，300 ℃。其他质谱条件见表2。

表2 质谱条件

1.5 样品前处理

称取5.00 g混匀后的样品于50 mL具塞离心管中，加入0.10 mL混合内标工作液，准确加入20 mL 0.2%甲酸乙腈，加盖后涡旋振荡10 min，以4 500 r/min常温离心10 min，吸取约3 mL上清液过PRiME HLB固相萃取柱（无需对小柱进行活化、淋洗等步骤），以1滴/s的速度过柱，弃去前几滴流出液，收集剩余续滤液，准确量取2.0 mL滤液于另一个15 mL离心管中，在45 ℃在氮吹至近干，用1 mL初始流动相溶解残渣，涡旋混匀，过0.22 μm PTFE滤膜，供UHPLC-MS/MS测定。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

根据金刚烷胺类药物化学结构的特点，其容易得到H+而形成[M+H]+准分子离子，故试验选择正离子模式监测，在正离子模式下一级全扫描质谱，得到相应的分子离子峰（[M+H]+）；通过优化锥孔电压，对母离子进行二级质谱分析，得到子离子特征碎片质谱图；选择特征碎片中离子中响应值高、基线噪声低的2对离子对作为定性、定量离子对，优化子离子对碰撞能量，使其丰度最大；进一步优化毛细管电压、雾化器压力、干燥和鞘气的温度及压力等质谱参数，经优化后得到表2的质谱参数。

2.2 色谱条件的选择

试验采用反相C18色谱柱对金刚烷胺类药物进行分离。分别考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水含2 mmol/L乙酸铵溶液、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水含2 mmol/L乙酸铵溶液等不同洗脱体系对目标物分离能力。结果表明，使用乙腈-0.1%甲酸水作为流动相时，目标物有良好的色谱分离效果，色谱峰峰型更好，且有较好的响应值。金刚乙胺和美金刚属同分异构体，同时它们的碎片离子完全相同，等度洗脱很难将其进行分离，故采用梯度洗脱的方式进行分离，通过优化流动相流速、组成和比例、柱温等色谱条件，结果见图2，经优化后得到表1的色谱条件。

图2 金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚标准溶液的TIC色谱图

2.3 样品前处理的优化

2.3.1 提取溶剂的选择

鸡蛋样品中富含蛋白质和脂肪等物质，因此在样品前处理时需要考虑沉淀蛋白和去除脂肪。乙腈具有沉淀蛋白的效果，常作为提取剂。试验分别考察了乙腈、80%乙腈、0.2%甲酸乙腈和80%乙腈（含0.2%甲酸）的提取效率。由图3可知，选取0.1%甲酸乙腈和80%乙腈（含0.2%甲酸）作为提取剂时，金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚的回收率大于90%，略高于乙腈、80%乙腈水的回收率，考虑到沉淀蛋白的效果和氮吹浓缩的时间，选用80%乙腈（含0.2%甲酸）作为提取溶剂。

图3 不同提取溶剂的回收率

2.3.2 净化柱的选择

试验采用PRiME HLB固相萃取小柱进行样品的净化。考察了混合型阳离子交换柱MCX及PRiME HLB固相萃取柱的保留效果，结果发现，采用MCX固相萃取柱能减少样品中杂质，且目标物损失较少，回收率在90%左右，但是使用MCX小柱净化操作步骤繁琐，耗时较长，且过程中使用大量有机试剂，对人体健康影响较大。采用PRiME HLB，酸化乙腈的提取液直接过柱，固相萃取小柱无需活化，目标物化合物通过小柱，样品中磷脂、脂肪等杂质被吸附于萃取柱，这样既能使干扰物有效去除，又确保待测组分损失较小，同时在净化过程中省去了溶剂转换的过程，简化了操作步骤，且目标物的回收率在90%左右，与MCX固相萃取柱回收率相当，故采用PRiME HLB固相萃取小柱进行净化。

2.4 样品的基质效应

使用ESI源质谱仪分析食品中兽药残留时，基质效应是时常遇到的现象，仪器的灵敏度和重现性易受基质效应的影响，同位素内标法因其性质与目标物相似，受基质影响程度相同，是液质联用分析中常采用的降低基质效应、提高定量准确性的一种方法[20]。试验选用金刚烷胺-D6和美金刚-D6作为内标物进行校正，金刚烷胺-D6作为金刚烷胺同位素内标物，美金刚-D6作为美金刚和金刚乙胺同位素内标物。由于样品溶液有已知浓度的同位素内标物，故减少了样品基质效应的影响，确保了方法的灵敏度、重现性和定量分析准确性。

2.5 标准曲线与最低检出限

在试验所确定的色谱和质谱条件下，分别配制3种药物质量浓度为0.025，0.05，0.10，0.20，0.50，1.25，2.50和5.00 μg/L的系列混合标准溶液（内标物质量浓度为0.50 μg/L）。以待测物标准溶液质量浓度为横坐标，以标准品定量离子对与内标物离子对峰面积的比值为纵坐标，分别绘制3种金刚烷胺类药物标准溶液工作曲线。结果表明，金刚烷胺类药物在0.025～5.00 μg/L的质量浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数（R2）在0.999 2以上，适用于定量分析。通过向阴性样品中添加目标物来考察方法的检出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10），结果见表3。说明该方法具有较好的灵敏度。

表3 线性范围、线性方程、相关系数（R2）、检出限和定量限

2.6 精密度及加标回收试验

采用在空白样品中添加标准溶液的方法进行加标回收试验，选取鸡蛋阴性样品，分别添加0.05，0.1和0.5 μg/kg 3个不同浓度，每个添加水平做6个平行，按照1.5小节方法进行提取净化，3个加标浓度连续做3 d，以考察方法的准确度和精密度，准确度以相对偏差表示，精密度以变异系数（C.V.）表示，计算加标回收率、日内变异系数和日间变异系数。标准溶液、空白样品和加标样品的MRM色谱图见图4～图6，结果如表4所示。目标分析物的准确度均小于15%，日内平均回收率为分别为：金刚烷胺，92.6%～102.0%；金刚乙胺，103.4%～109.5%；美金刚，91.6%～96.6%。日内变异系数分别为：金刚烷胺，4.7%～9.8%；金刚乙胺，2.8%～3.0%；美金刚，1.7%～5.2%。日间平均回收率分别为：金刚烷胺，89.9%～99.1%；金刚乙胺，97.9%～105.5%；美金刚，97.4%～98.8%。日间变异系数分别为：金刚烷胺，2.7%～3.0%；金刚乙胺，3.4%～5.1%；美金刚，3.1%～6.8%。说明该方法具有良好的重复性与稳定性，能够满足鸡蛋样品中金刚烷胺类药物残留分析检测的要求。

表4 加标回收率和精密度

图4 金刚烷胺类药物标准溶液（0.25 μg/L）MRM色谱图

图5 鸡蛋空白样品MRM色谱图

图6 鸡蛋空白样品加标（0.5 μg/kg）MRM色谱图

2.7 方法的应用

选取100批次市售的鸡蛋样品，按此次试验建立的方法进行测定。其中，3个样品检测出金刚烷胺，含量分别为0.925，1.69和28.8 μg/kg，其他两种药物均未检出。

3 讨论与结论

此次试验建立了同时测定鸡蛋中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚残留量的同位素稀释超高效液相色谱-串联质谱法的快速检测方法。以0.1%甲酸乙腈水溶液作为提取剂，用PRiME HLB固相萃取柱净化。结果表明，金刚烷胺类药物在6 min内完成分析，相关系数在0.999 2以上，检出限为0.5 μg/kg，在0.5，1和2 μg/kg 3个添加水平下的准确度均小于15%，3种药物平均回收率在89.9%～109.5%之间，日内（n=6）变异系数在1.7%～9.8%之间，日间（n=3）变异系数在2.7%～6.8%之间。该方法操作简单、回收率高、重现性好，具有良好的准确度和精密度，能够准确定性和定量分析金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚，为鸡蛋中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚残留量的检测提供技术支撑，为监管部门及食品安全提供更多的理论依据。