八角茴香提取液的抑菌效果及稳定性探讨

孙长花 ，王征远，刘俊，王晟

1. 扬州市职业大学生物与化工工程学院（扬州 225009）；2. 扬州大学江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室（扬州 225009）

随着社会经济发展和生活水平不断提高，食品安全成为消费者和食品工业共同关心的热点问题。化学防腐剂残留问题凸显，对天然防腐剂需求不断增加，天然植物源食品防腐剂由于其安全高效的特点受到广泛关注[1]。其中，天然食用香辛料因具有抑菌[2]、抗氧化[3-4]作用，对其防腐保鲜的研究成为热点。

八角茴香（Illicium verum），又称八角、大茴香等，是木兰科八角属植物八角树的果实，其性温、味辛，是我国重要的“药食同源”植物材料[5]。八角的主要成分是八角挥发油（茴香油），主要成分为反式茴香脑，另含有少量的反式肉桂醛和甲基丁香酚等[6-7]，具有抑菌作用[8-9]。关于八角茴香中抑菌成分研究主要集中于提取方法和工艺[10-13]，以及在食品防腐保鲜的应用[14-15]，而未见其抑菌稳定性的研究报道。试验旨在对八角茴香提取液的抑菌作用、最小抑菌浓度及影响抑菌稳定性的因素进行研究，以期为八角茴香作为天然防腐剂原料在食品防腐保鲜中的运用提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

八角（产地广西，扬州众成堂大药房）；大肠杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（扬州市职业大学微生物实验室提供）；平板计数琼脂培养基；无水乙醇、丙酸、氢氧化钠、浓盐酸、氯化钠、氯化钙、氯化钾、硫酸亚铁、氯化铁（均为分析纯）。

1.2 仪器与设备

JA2003N电子天平（上海精密仪器有限公司）；多功能粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）；JY92-IIDN超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE-2000A旋转蒸发仪（上海贤德实验仪器有限公司）；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台（苏州净化设备厂）；HPX-80生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；DHG-9003电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 八角茴香提取液的制备

八角茴香粉碎，过孔径0.180 mm筛。准确称取一定量粉末，按照料液比1∶10（g/mL）加入95%乙醇溶液，置于超声波破碎仪中浸提50 min。采用真空泵抽滤，收集滤液，真空低温旋转蒸发，制得八角茴香提取液。

1.3.2 菌悬液的制备

将实验室提供的菌种进行活化，并用平板稀释法测定菌落总数。用无菌生理盐水将活化后的细菌稀释为含菌数5×108CFU/mL的菌悬液。

1.3.3 抑菌圈的测定——牛津杯法

取各种供试菌悬液100 μL于平板上，均匀涂布。用镊子将3只无菌的牛津杯放入培养皿中，轻轻按压，使牛津杯和培养基表面接触紧实。吸取250 μL八角茴香提取液至牛津杯中。将培养皿正置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后观察，用游标卡尺测量抑菌圈直径。每组重复3次，取平均值[16]。设置无菌水作阴性对照，并以0.5%山梨酸钾溶液的抑菌试验作阳性对照。

1.3.4 最低抑菌浓度

采用二倍稀释法[17]，将八角茴香提取液（1 g/mL）用无菌水稀释为原溶液的100%，50%，25%，12.5%，6.25%，3.125%，1.563%和0.782%等8个浓度（即提取液浓度分别为1.000 0，0.500 0，0.250 0，0.125 0，0.062 5，0.031 2和0.015 6 g/mL），分别吸取1 mL不同稀释度的提取液至无菌平皿中，加15 mL培养基，充分混合均匀。待培养基冷却凝固后，取100 μL供试菌悬液于平板上，均匀涂布。将培养皿倒置于培养箱中，37 ℃条件下培养24 h，观察供试菌生长状况，每组重复3次。

1.3.5 热处理对八角茴香提取液抑菌稳定性的影响

将八角茴香提取液分别在65，80，100和121 ℃下处理30 min，以未处理过的提取液作对照，分别对供试菌进行抑菌试验，测定抑菌圈直径，每组重复3次。

1.3.6 pH对八角茴香提取液抑菌稳定性的影响

用丙酸或NaOH溶液将八角茴香提取液分别调至pH 2，4，8和10，以未处理过的提取液（pH 6）作对照，分别对供试菌进行抑菌试验，测定抑菌圈直径，每组重复3次。

1.3.7 紫外线照射对八角茴香提取液抑菌稳定性的影响

将八角茴香提取液分别在紫外灯下照射10，20，30和40 min，以未处理过的提取液作对照，分别对供试菌进行抑菌试验，测定抑菌圈直径，每组重复3次。

1.3.8 金属离子对八角茴香提取液抑菌稳定性的影响

八角茴香提取液中分别加入1 mol/L K+、Na+、Ca+、Fe2+、Fe3+等，以未处理过的提取液作对照，分别对供试菌进行抑菌试验，测定抑菌圈直径，每组重复3次。

1.3.9 数据处理与分析

采用Graphpad Prism 7.0进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 八角茴香提取液的抑菌效果

采用牛津杯法，研究八角茴香提取液对常见致病细菌的抑菌效果，结果见图1。

从图1可以看出，八角茴香提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌抑菌作用明显，形成明显的抑菌圈，且抑菌圈的直径明显比同等条件下0.5%山梨酸钾的抑菌圈直径大。通过抑菌圈直径测量可知，八角茴香提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈直径分别为29.6，30.2，33.5和34.8 mm；山梨酸钾溶液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈直径分别为13.6，12.8，12.2和17.1 mm。因此，八角茴香提取液对食品中常见的细菌具有良好抑菌效果。

图1 八角茴香提取液对常见细菌的抑菌效果

2.2 八角茴香提取液的最低抑菌浓度

采用二倍稀释法，进行八角茴香提取液最低抑菌浓度试验，确定八角茴香提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度。结果如表1所示。

由表1可知，八角茴香提取液对不同细菌的最低抑菌浓度不同。八角茴香提取液浓度0.031 2 g/mL时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌出现菌落，则八角茴香提取液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度0.062 5 g/mL；八角茴香提取液浓度稀释到0.015 6 g/mL时，枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌有菌落出现，表明八角茴香提取液对二者的最低抑菌浓度为0.031 2 g/mL。

表1 八角茴香提取液的最低抑菌浓度

2.3 热处理对八角茴香提取液抑菌稳定性的影响

在食品的加工过程中，热处理是常用工序，探究对八角茴香提取液进行不同条件的热处理，并进行抑菌试验，确定其热稳定性，结果见图2。

由图2可以看出，随着热处理温度提高，八角茴香提取液对4种供试菌的抑菌效果呈下降趋势。经过65 ℃和80 ℃加热处理，提取液对4种供试菌的抑菌圈直径小幅减小，抑菌效果略有下降，但仍然保持明显抑菌作用。经过100 ℃处理后，抑菌圈直径减小23%以上，其中对表皮葡萄球菌的抑菌圈直径减小30.7%，抑菌效果下降。尤其是经过121 ℃处理后，提取液的抑菌圈直径减小超过43%，抑菌效果明显大幅下降。表明八角茴香提取液具有热敏性，长时间的高温处理明显影响其抑菌效果，因此，八角茴香提取液应用于食品保鲜时，应避免长时间高温处理。

图2 热处理对八角茴香提取液抑菌效果的影响

2.4 pH对八角茴香提取液抑菌稳定性的影响

由图3可以明显看出，八角茴香提取液的抑菌效果受pH影响，且变化显著。与对照相比，在中性及酸性条件下，提取液抑菌圈直径大小没有明显变化，抑菌效果均较好，但在碱性条件下，提取液未形成抑菌圈，完全没有抑菌效果。结果表明，提取液在酸性条件下稳定性好，而在碱性环境中被破坏，因此，将八角茴香提取液应用于食品保鲜时，不宜用于碱性环境。

图3 pH对八角茴香提取液抑菌稳定性的影响

2.5 紫外照射对八角茴香提取液抑菌稳定性的影响

由图4可知，和对照相比，经过不同时长的紫外照射处理，八角茴香提取液的抑菌圈直径并未出现明显变化，提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈直径变化分别小于5.4%，9.3%，7.8%和8.9%，抑菌活性基本保持稳定。结果表明，八角茴香提取液抑菌性对紫外照射的稳定性较好。

2.6 金属离子对八角茴香提取液抑菌稳定性的影响

由图5可以看出，加入K+、Na+、Ca+、Fe2+、Fe3+等金属离子后，对八角茴香提取液的抑菌效果的影响较小，提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈直径变化分别小于6.1%，12.2%，8.7%和11.5%，抑菌活性较稳定。结果表明，八角茴香提取液的抑菌作用对金属离子的稳定性较好。

图4 紫外照射对八角茴香提取液抑菌稳定性的影响

图5 金属离子对八角茴香提取液抑菌稳定性的影响

3 结论与讨论

八角茴香的主要成分含茴香油，具有抑菌防腐作用。八角茴香提取液对食品中常见的细菌抑菌作用明显，其中对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈直径分别为29.6，30.2，33.5和34.8 mm。八角茴香提取液对不同细菌的最低抑菌浓度也不同，其中对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.062 5 g/mL，对枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.031 2 g/mL。

对八角茴香提取液的抑菌稳定性研究发现，八角茴香提取液在酸性环境、紫外照射和K+、Na+、Ca+、Fe2+、Fe3+等金属离子存在情况下，具有较好抑菌稳定性，但是对长时间高温处理和碱性环境敏感。因此，八角茴香提取液可以适用于多种食品的防腐保鲜，应用时避免长时间高温处理和碱性环境。

八角茴香是生活中常见的香料，其价格低、分布广、来源泛、易获取。八角中含有的天然抑菌成分对常见细菌的抑菌效果好，且对加工条件具有广泛适用性，因此，八角茴香作为天然防腐剂原料进行研究开发，并运用于食品的防腐保鲜，具有较好应用前景。