GATA4基因甲基化及GATA4对非小细胞肺癌生长的影响及其作用机制

夏宇曾敏贾斌孙峰刘雪梅王海月

作者单位：830054 乌鲁木齐 1新疆医科大学第一附属医院呼吸与呼吸危重症中心二病区；830011 乌鲁木齐 2新疆医科大学附属肿瘤医院胸腹放疗科

肺癌发病率和死亡率在全球癌症中分别居第2位和第 1位［1］。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的75%以上，多数NSCLC患者确诊时已属晚期，预后较差［2］。有研究显示DNA甲基化与肺癌发生风险相关［3］。GATA4是锌指转录因子家族成员之一，其活性受翻译后修饰调控，包括磷酸化、乙酰化、甲基化和类泛素化修饰［4］。在卵巢癌中，GATA4常因启动子异常甲基化而被沉默［5］。也有研究显示GATA4在NSCLC细胞中呈甲基化状态，CD40配体通过促进GATA4去甲基化，上调GATA4表达，介导NSCLC细胞DNA损伤反应并促进细胞衰老［6］。但是目前GATA4在NSCLC中的作用及其机制尚不明确。本研究探讨GATA4在NSCLC组织中的甲基化状态及其对NSCLC细胞生长的影响和可能的调控机制，以期明确GATA4在NSCLC中的作用，为阐明NSCLC发病机制及开发新的临床治疗靶点提供依据。

1 材料和方法

1.1 组织标本

收集2017年7月—2018年6月于新疆医科大学第一附属医院接受肺癌根治术的78例NSCLC患者癌组织及其癌旁组织。年龄34～77岁，平均年龄（57.7±12.9）岁，其中男性56例；肺腺癌 46例，肺鳞状细胞癌32例。纳入标准：⑴经组织病理学诊断为NSCLC；⑵顺利行肺癌根治术；⑶术前未接受放疗、化疗、生物疗法等抗癌治疗。排除标准：⑴合并其他恶性肿瘤者；⑵合并严重心、肝、肾等重要脏器功能损伤或其他严重基础疾病者。本研究经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审批通过，患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要材料

人肺癌细胞株 A549、HCC827、NCI-H1299 和人正常肺上皮细胞BEAS-2B购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，用含10%FBS的RPMI 1640培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养。血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；DNA重亚硫酸盐转化试剂盒购自英国沃特曼；GATA4、p-ERK、ERK和p38抗体购自英国Abcam公司；p-p38抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；GATA4干扰（sh-GATA4-1和sh-GATA4-2）及其阴性对照（sh-NC）、GATA4过表达载体（pLV-GATA4）及其空载体对照的慢病毒液（pLV-NC）购自武汉金开瑞生物工程有限公司；CCK-8检测试剂盒购自美国MedChem Express公司；Annexin V-FITC/PI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.3 MSP检测组织和细胞GATA4基因甲基化状态

按照DNA提取试剂盒说明书提取各组细胞和组织中的总DNA，并测定DNA浓度及纯度。参照DNA重亚硫酸盐转化试剂盒说明书的操作步骤进行DNA重亚硫酸盐转化及DNA纯化。根据GATA4基因序列信息，利用Methyl Primer Express v1.0软件设计GATA4基因的甲基化引物和去甲基化引物然后进行PCR反应。甲基化上游引物为5′-GTATAGTTTCGTAGTTTGCGTTTAGC-3′，下游引物为 5′-AACTCGCGACTCGAATCCCCG-3′；去甲基化上游引物为 5′-TTTGTATAGTTTTGTAGTTTGTGTTTAGT-3′，下游引物为 5′-CCCAACTCACAACTCAAATCCCCA-3′。PCR扩增条件：95℃3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共 40个循环；72 ℃10 min。反应结束后，PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。PCR产物大小为140 bp。

1.4 qMSP检测组织中GATA4基因甲基化程度

参考文献［7］，应用qMSP检测组织中GATA4基因甲基化程度。按照步骤1.3进行组织DNA提取、DNA重亚硫酸盐转化及DNA纯化。制备非甲基化DNA作为阴性对照，完全甲基化DNA为阳性对照，两者以不同比例混合，分别配制成0、10%、25%、50%、75%、90%和100%DNA甲基化标准样本，进行RT-PCR扩增，绘制标准曲线。将已处理的组织DNA作为模板进行RT-PCR实验，计算GATA4基因甲基化程度（%）。GATA4上游引物为5′-ATAAAGCTGACCCTGGGCAC-3′，下游引物为 5′-GGGTGAATTCAGCTGCTCCT-3′。

1.5 RT-PCR检测GATA4 mRNA表达

用Trizol试剂提取各组细胞和组织中的总RNA，并逆转录为cDNA。按照SYBR®RPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书的操作步骤进行RT-PCR实验。反应条件：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 个循环。以GAPDH为内参，采用 2-ΔΔCt法计算 mRNA表达。GATA4上游引物为5′-ATAAAGCTGACCCTGGGCAC-3′，下游引物为 5′-GGGTGAATTCAGCTGCTCCT-3′；GAPDH 上游引物为 5′-TGGGTGTGAACCATGAGAAG-3′，下游引物为5′-GTGTCGCTGTTGAAGTCAGA-3′。

1.6 Western blot检测 GATA4、p-ERK、ERK、p-p38和p38蛋白表达

用RIPA裂解液裂解细胞或组织，取上清液，并根据BCA法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白进行SDS-PAGE分离，用湿转法将蛋白转至PVDF膜上，10%脱脂奶粉室温封闭 3 h 后，分别加入 GATA4 抗体（1∶5 000）、p-ERK 抗体（1∶1 000）、ERK 抗体（1∶1 000）、p-p38 抗体（1∶1 000）、p38 抗体（1∶2 000）和 GAPDH 抗体（1∶5 000），4℃孵育过夜；次日加入HRP标记的二抗（1∶5 000），室温孵育1 h。加入ECL发光液，显色、暗室曝光。用Image J软件测定蛋白条带的灰度值，以GAPDH为内参进行目的蛋白相对定量。

1.7 慢病毒感染细胞

将对数期生长的A549细胞接种于6孔板中，接种密度为4×105/mL，于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，更换培养基为含6 μg/mL polybrene的2 mL新鲜培养基，将MOI=70的GATA4干扰sh-GATA4-1和sh-GATA4-2慢病毒液（sh-GATA4组）、干扰载体阴性对照慢病毒液（sh-NC组）、GATA4过表达载体慢病毒液（pLV-GATA4组）及其空载体对照慢病毒液（pLV-NC组）加至细胞中，同时设置空白对照组（Blank组），转染48 h后，进行后续实验。

1.8 CCK-8实验检测细胞活力

将各组转染后的细胞以5×103/孔接种于96孔板，每组设置3个复孔，分别于细胞培养0 h、24 h、48 h和72 h时，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，于37℃条件下孵育3 h后，采用酶标仪测定波长450 nm处的光密度（OD）值。以OD值为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。

1.9 细胞克隆形成实验检测细胞增殖情况

用0.25%胰酶消化对数期生长的A549细胞，并制成单细胞悬液。取5 mL含200个A549细胞悬液接种于60 mm培养皿中，于37℃、5%CO2培养箱中培养2周，用PBS清洗，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染液染色1 h，流水缓慢洗去染液，空气干燥。

1.10 流式细胞术检测细胞凋亡

将转染后的各组A549细胞以2.5×106/mL密度接种于6孔培养板，培养24 h后加入300 μL的1×Binding Buffer重悬细胞。加入 5 μL的 Annexin V-FITC染液，混匀，室温避光孵育15 min。随后加入5 μL 的 PI染液，补加 200 μL 的 1×Binding Buffer，上流式细胞仪进行检测。

1.11 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行数据分析。计量数据以均数±标准差（±s）表示，GATA4在 NSCLC 组织和癌旁组织中的甲基化水平差异以及GATA4基因甲基化状态与患者临床病理特征的关系采用χ2检验；GATA4基因甲基化程度与GATA4 mRNA表达，GATA4、p-ERK、p-p38和Bcl-2蛋白表达的相关性采用Spearman相关分析；NSCLC组织和癌旁组织间比较采用配对样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，则采用LSD-t检验进行多重比较。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GATA4在NSCLC组织和细胞中的表达及甲基化情况

NSCLC组织中GATA4基因甲基化率为74.4%，高于癌旁组织的 16.7%（χ2=22.941，P ＜0.001）；GATA4 mRNA和蛋白表达低于癌旁组织（P＜0.001）。GATA4基因甲基化程度与GATA4 mRNA和蛋白表达呈负相关（r=-0.736，-0.643，均 P＜0.001），见图 1。GATA4 基因在A549和HCC827细胞中呈完全甲基化状态，在NCI-H1299细胞中呈未完全甲基化，而在BEAS-2B细胞中呈去甲基化。A549、HCC827和NCI-H1299细胞中GATA4 mRNA和蛋白表达低于BEAS-2B细胞（均P＜0.01），其中在A549细胞中表达最低，因此选取A549细胞进行后续实验。见图2。

2.2 NSCLC组织中GATA4基因甲基化状态与患者临床病理特征的关系

NSCLC组织中GATA4基因甲基化状态与TNM分期和肿瘤大小有关（均P＜0.05），但与年龄、性别和病理学类型无关（均P＞0.05），见表1。

2.3 GATA4基因甲基化对NSCLC组织中p-ERK、p-p38、Bax和Bcl-2表达的影响

Western blot检测结果显示，NSCLC组织中p-ERK、p-p38、Bcl-2蛋白表达均高于癌旁组织（均P＜0.001），Bax蛋白表达低于癌旁组织（P＜0.001）。GATA4基因甲基化程度与p-ERK、p-p38和Bcl-2蛋白表达呈正相关（P=0.008；P=0.011；P=0.007），与 Bax蛋白表达呈负相关（P=0.005）。见图3。

2.4 sh-GATA4对A549细胞的干扰作用

RT-PCR和Western blot实验结果显示，sh-GATA4-1和sh-GATA4-2组细胞中GATA4 mRNA和蛋白表达低于 sh-NC 组（P＜0.001；P=0.008），其中 sh-GATA4-1组表达最低，因此选取sh-GATA4-1进行后续实验（记为sh-GATA4组）。见图4。

图1 GATA4在NSCLC组织和癌旁组织中的表达Fig.1 Expression of GATA4 in NSCLC tissues and paracancerous tissues

图2 GATA4在肺癌细胞和正常肺上皮细胞中的表达Fig.2 Expression of GATA4 in lung cancer cells and normal lung epithelial cells

图3 GATA4基因甲基化对肺癌组织中p-ERK、p-p38、Bax和Bcl-2表达的影响Fig.3 The effect of GATA4 gene methylation on the expression of p-ERK,p-p38,Bax and Bcl-2 in lung cancer tissues

2.5 GATA4过表达抑制NSCLC细胞增殖

pLV-GATA4组细胞中GATA4 mRNA和蛋白表达高于 pLV-NC 组（均 P＜0.001），24 h、48 h、72 h细胞活力和细胞克隆数均低于pLV-NC组（均P<0.05）；sh-GATA4组细胞中GATA4 mRNA和蛋白表达低于sh-NC 组（均 P＜0.001），24 h、48 h、72 h细胞活力和细胞克隆数高于sh-NC组（均P<0.05），见图5。

2.6 GATA4过表达促进NSCLC细胞凋亡

图4 sh-GATA4对A549细胞的干扰作用Fig.4 Interference of sh-GATA4 on A549 cells

表1 NSCLC组织中GATA4基因甲基化状态与患者临床病理特征的关系（n）Tab.1 Relationship between the methylation status of GATA4 gene in NSCLC tissues and the clinicopathological characteristics of patients（n）

流式细胞术检测结果显示，pLV-GATA4组细胞凋亡率高于pLV-NC组（P＜0.001），sh-GATA4组细胞凋亡率低于sh-NC组（P=0.007），见图6。

2.7 GATA4过表达抑制MAPK通路活化

Western blot实验结果显示，pLV-GATA4组细胞p-ERK/ERK和p-p38/p38蛋白表达低于pLV-NC组（P=0.005；P＜0.001），sh-GATA4 组 p-ERK/ERK 和 p-p38/p38蛋白表达高于sh-NC组（P＜0.001；P=0.007）。见图7。

图5 GATA4过表达抑制NSCLC细胞增殖Fig.5 Overexpression of GATA4 inhibited the proliferation of NSCLC cells

3 讨论

图6 GATA4过表达促进NSCLC细胞凋亡Fig.6 Overexpression of GATA4 promoted the apoptosis of NSCLC cells

图7 GATA4过表达抑制MAPK通路活化Fig.7 Overexpression of GATA4 inhibited MAPK pathway activation

GATA锌指转录因子家族由6个成员（GATA1～6）组成。其中GATA4在心脏和肺发育中起关键作用［8］，其异常表达也与肿瘤发生和恶性进展相关，被认为是癌症治疗的重要候选基因［9］。在口腔鳞状上皮细胞癌组织和细胞中GATA4启动子高度甲基化，且其甲基化状态与患者总体生存率相关［10］。几乎所有乳腺癌细胞系中也都存在GATA4基因甲基化，在乳腺癌组织和细胞系中GATA4表达降低还与预后不良相关，而GATA4过表达可降低乳腺癌细胞存活率、侵袭迁移能力及上皮-间质转化，诱导细胞周期阻滞和凋亡［11］。本研究在NSCLC组织和细胞中同样发现GATA4基因启动子高度甲基化，GATA4呈低表达，相关分析发现GATA4基因甲基化程度与GATA4 mRNA表达和蛋白表达呈负相关，此外GATA4基因甲基化水平还与患者TNM分期和肿瘤大小相关。说明GATA4基因启动子高度甲基化可导致GATA4表达降低，从而参与NSCLC疾病进展。

细胞凋亡是细胞发育和程序性死亡的主要机制［12］。而细胞凋亡途径受Bcl-2家族调控，该家族由促凋亡成员（如 Bax、Bak、Bad、Bcl-xs、Bid、Bik、Bim、HRK、Noxa和 PUMA）和抗凋亡成员（如 Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-W、BFL-1和 MCL-1）组成［13］。DNA损伤、能量饥饿和缺氧等细胞应激反应可使促凋亡蛋白去磷酸化和裂解，致使其移位到线粒体，最终导致细胞凋亡［14］。既往研究显示Bcl-2家族蛋白在NSCLC中表达异常，Bcl-2上调及Bax下调与临床耐药有关［15］。本研究检测肺癌组织中促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，发现Bax蛋白表达下调而Bcl-2蛋白上调，且GATA4基因甲基化程度与Bcl-2蛋白表达呈正相关，而与Bax蛋白表达呈负相关，说明GATA4基因甲基化与细胞凋亡呈负相关。进一步采用慢病毒载体构建过表达GATA4和干扰GATA4的肺癌A549细胞株，发现过表达GATA4可抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，而敲低GATA4则反之，说明过表达GATA4在NSCLC中发挥抗肿瘤作用。

MAPK家族由ERK1/2、p38和JNK三个主要成员组成，可以调节细胞增殖、分化和凋亡等多种细胞过程［16］。既往研究报道激活MAPK通路中的ERK、JNK和p38可增强肺癌细胞抵抗放射线及对DNA损伤修复的能力［17］。在GATA4过表达细胞中也发现显著差异表达的基因部分富集在MAPK通路［18］，且过表达GATA4可抑制MAPK通路激活［19］。本研究结果显示，p-ERK和p-p38蛋白在肺癌组织中表达上调，且与GATA4基因甲基化程度呈正相关，提示GATA4基因甲基化可能激活MAPK通路。为了验证GATA4与MAPK通路的关系，进一步进行细胞验证，发现过表达GATA4可降低ERK和p38磷酸化水平，抑制MAPK通路活化；而干扰GATA4则提高了ERK和p38磷酸化水平，促进MAPK通路活化。说明GATA4可能通过抑制MAPK通路下游靶标ERK和p38磷酸化而在NSCLC细胞中发挥抗肿瘤作用。

综上所述，GATA4在NSCLC组织和细胞中均呈高度甲基化，上调GATA4可能通过调控MAPK通路抑制NSCLC细胞增殖，诱导细胞凋亡。GATA4可能是NSCLC治疗的潜在靶点。