树上干杏指纹图谱构建与亲缘关系研究初探

丛桂芝 王瑾 陈淑英 石游 陶俊 阿布地萨拉木·艾尼外尔 许正

摘要：为进一步探究树上干杏亲缘关系，本研究利用SSR分子标记引物技术，通过PCR扩增及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对树上干杏等9个杏品种（类型）的18对SSR多态性引物进行鉴定，获得DNA指纹图谱，从DNA水平鉴定伊犁树上干杏品种与其他杏品种（类型）之间的亲缘关系远近。对各杏品种（类型）间亲缘关系进行聚类分析，结果表明：杏1（树上干杏1号）和杏2（树上干杏2号）2个品种差异较大，杏4（树上干杏4号）与杏1（树上干杏1号）为同一类。与杏1（树上干杏1号）亲缘关系由近及远依次为巩留野杏、珍珠油杏、第四师61团古杏，其遗传相似性系数范围为0.673～0.808。杏3（树上干杏3号）与杏2（树上干杏2号）为同一类，与李光杏亲缘关系较近，其遗传相似性系数范围为0.654～0.846。霍城野杏与树上干杏亲缘关系较远。

关键词：树上干杏；SSR分子标记；DNA指纹图谱；聚类分析；亲缘关系

中图分类号：S662.2文献标志码：A论文编号：cjas20191100269

The Fingerprint Structure and Genetic Relationship of Shushanggan Apricot： A Preliminary Study

Cong Guizhi， Wang Jin， Chen Shuying， Shi You， Tao Jun， Abudusalamu Ainiwaier， Xu Zheng

（Ili Academy of Forestry Sciences， Ili 835000， Xinjiang， China）

Abstract： To explore the genetic relationship of Shushanggan apricot， SSR molecular marker technology was used by PCR amplification and a modified polyacrylamide gel electrophoresis， 18 pairs of SSR polymorphism primers were identified in nine varieties （types） of Shushanggan apricot and other apricots， to get the DNA fingerprint. The genetic relationship between Shushanggan apricot and other apricot varieties （types） were identified from different DNA levels. The genetic relationship of apricot varieties （types） were analyzed by clustering. The results showed that Shushanggan apricot had two different varieties， namely Shushanggan apricot No.1 and Shushanggan apricot No.2. Shushanggan apricot No.4 and Shushanggan apricot No.1 were the same type. The close genetic relationship to Shushanggan apricot No.1 was Gongliu wild apricot>pearl oil apricot>Disishi 61 Tuan ancient apricot， the genetic similarity coefficient ranged from 0.673 to 0.808. Shushanggan apricot No.3 and Shushanggan apricot No.2 were the same type， and they were closely related to Liguang apricot， the genetic similarity coefficient ranged from 0.654 to 0.846. Huocheng wild apricot was far related to Shushanggan apricot.

Keywords： Shushanggan Apricot； SSR Molecular Marker； DNA Fingerprint； Cluster Analysis； Genetic Relationship

0引言

遺传多样性是物种适应自然和进化的基本特征，它源于不同的核酸序列和基因突变。天然树木躯体的遗传多样性程度受遗传漂变、迁移、突变和选择等综合因素的影响，其基因频率会在一定的水平上波动，反映在核酸水平上会呈现出特定DNA片段的多态性[1-2]。因此，利用分子标记技术对遗传多样性进行快速检测，可以免受环境、组织特异性和发育阶段的影响[3]。

在种质资源研究领域中分子标记主要应用在2个方面。首先是指纹图谱的构建，用于种质资源的鉴定；其次是对种质资源间的遗传多样性进行研究，区分品质间的亲缘关系[4-5]。由于样本基因组微卫星座位的复等位性，使该技术易于鉴别同一物种的不同基因型，从而反映出样本间的差异性[6]。SSR技术在果树种质资源的研究领域中应用很广泛。何天明等[7]从核果类果树种质资源的遗传分析角度出发，主要从品种鉴定和亲缘关系分析、一些重要农艺性状的标记以及遗传连锁图谱的构建等方面对SSR分子标记技术在这一领域的研究进展进行了综述。俞明亮等[8]应用SSR标记技术分析桃种间的演化模式，同时采用集群分离分析法对白肉/黄肉、毛桃/油桃、花粉可育/花粉败育3个性状进行了标记研究，开创了分子标记辅助育种技术在桃种质遗传育种研究领域应用的先河。何天明等[9]用SSR标记技术鉴定了中国西部伊犁山谷野山杏的群体遗传结构。Graharm等[10]通过10个随机引物扩增的指纹图谱区分了10个树梅品种。Thomas等[11]利用5对引物对葡萄进行PCR扩增，成功区分了33个不同的葡萄品种。Galli等[12]利用SSR分子标记区分了苹果的66个栽培品种。

对于相同物种的不同品种来说，含有大量的多态性标记，任何品种都有不同于另外品种的特有标记，也就是一些特异性DNA片段的组合，称为该物种的“指纹”，DNA指纹图谱技术是对遗传物质的多态性直接分析与检测，以此诊断物种基因的分布和表现规律，已经在果树种质资源研究中广泛地应用[13-15]。由于是以DNA的形式直接表现，其反映出来的差异也就是基因型差异，所以更为可观精准，是目前应用最为广泛的指纹图谱技术[16-18]。

树上干杏属新疆杏的地方品种，为中亚品种群[19]，为小果杏类品种，是新疆伊犁河谷特有鲜食、制干兼仁用的乡土杏良种，果实个小质轻，单果质量10～30 g，鲜杏成熟后，色泽黄中带红，非常鲜艳，果肉香甜美味，干杏果肉纯美甘甜，杏核极薄，轻嗑即食，果仁香甜，营养物质含量丰富，口感好，风味独特，品质极佳，可在树枝上自身脱水风干不落，俗称“吊死干”，当地哈语为“梅孜吴尔克”，维语为“古丽卡克”，商品名树上干杏[20]。

伊犁地区天山野杏林是国内野杏的重要集中地，天山野杏是栽培杏的直接祖先，主要分布在海拔950～ 1400 m的低山带，是落葉阔叶林的重要组成树种，有些新疆野杏及野生类型杏因品质优良，完全可与栽培杏的优良品种相媲美[21]。

为进一步探究树上干杏亲缘关系，本研究采用SSR（simple sequence repeat）分子标记技术[22]，利用不同地域9个杏品种（类型）的18对SSR引物进行遗传多样性研究，获得DNA指纹图谱，旨在为确定树上干杏品种亲缘关系提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料

本研究选择新疆伊犁河谷树上干杏3个选育品种（树上干杏1号、树上干杏2号、树上干杏3号）及优良类型树上干杏4号，与分布在河谷不同地域内、同树上干杏性状相近的2个栽培品种（李光杏、珍珠油杏）、1棵古杏、2个野杏类型，合计9个杏品种（类型）为试验材料（表1）。

1.2方法

1.2.1 DNA提取采用改良CTAB法提取杏基因组DNA[23]，并进行DNA样品浓度和纯度的测定。具体操作步骤如下：（1）取幼嫩真叶材料一小片，用蒸馏水冲洗干净，置1.5 mL的离心管中，加液氮，快速冷却。（2）将材料快速研磨成粉末，然后加入65℃预热的CTAB提取缓冲液700μL。（3）放入65℃水浴30～40 min，每10 min轻轻地振荡一次。（4）加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1） 700μL，混匀5 min，12000 r/min离心5 min。（5）取上清液转入另一1.5 mL新离心管中，加入经冰箱冷藏处理的无水乙醇800μL，放置于4℃10 min左右，让DNA充分沉淀。（6）小心清除无水乙醇、加入经冰箱冷藏处理70%乙醇漂洗2次。（7）室温晾干，轻轻弹离心管，至没有水滴即可。（8）将DNA溶于50μL或100μL的0.1倍TE中，加入RNase （10 mg/mL） 1μL于37℃消化15～30 min。（9）于-20℃或4℃保存。

1.2.2 SSR标记引物序列的获得及合成通过引物筛选，将多态性丰富且稳定性好的SSR引物用于杏品种（类型）的鉴定及遗传多样性分析[24]。

1.2.3 SSR反应体系扩增SSR标记技术反应物混匀后于PCR仪（PTC-200TMPeltiter thermal cycler）上扩增。见表2。

1.3非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR扩增产物，PCR产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。电泳仪和电泳槽分别使用北京君意东方电泳设备有限公司的JY600C电泳仪和北京市六一仪器厂的DYCZ-30电泳槽。聚丙烯酰胺凝胶溶液的配制见表3。

1.4银染程序[25]

1.4.1固定将玻璃板从电泳槽取下，拔出梳子，并轻轻将长板取下，胶面朝上放入盛有2000 mL固定液（1800 mL蒸馏水+200 mL无水乙醇+10 mL乙酸）的塑料盒中，在摇床上轻摇7 min。

1.4.2染色倒入2000 mL染色液（2000 mL蒸馏水+3 g AgNO3），在摇床上染色7 min，倒去染色液，用蒸馏水漂洗约30 s。

1.4.3显色倒入2000 mL显色液（2000 mL蒸馏水+30 g NaOH+4 mL CH2O），在摇床上轻摇至条带清晰地显出，倒去显色液。

1.4.4定影用步骤1.4.1中回收的固定液定影约30 s。

1.4.5漂洗倒入2000 mL蒸馏水漂洗约30 s。

取出后自然晾干，扫描或照相保存。以上银染中所用的各溶液需要现配现用，不可久存。

1.5谱带记录及数据分析

1.5.1反应条带观察及统计凝胶干燥后，形成DNA多态性图谱，对胶片上的SSR条带进行量化处理，并以0、1方式记录。将图谱上清晰的条带记为“1”，同一位置没有条带记为“0”，生成“1”和“0”组成的原始矩阵。

1.5.2数据分析SSR转化成1、0数据后，利用NTSYS-2.10e软件中的SIMQUAL程序求Dice相似系数矩阵：用SHAN程序中的UPGMA方法进行聚类分析。

2结果与分析

2.1 SSR引物筛选

通过引物筛选，将多态性丰富且稳定性好的SSR引物用于杏品种（类型）的鉴定及遗传多样性分析，筛选引物组合见表4。

2.2引物筛选鉴定

从18对引物中筛选出6对能将9份材料鉴别出来的具有良好多态性的SSR引物，将9个杏材料归纳鉴定为9个独立的个体。具体鉴定结果见图1。

2.3数据聚类分析

采用6对SSR引物对9种杏材料进行鉴定，通过聚类分析将9份材料分为3类（见图2）。其中杏8（霍城野杏）材料分别为独立的一类。杏2（树上干杏2号）、杏3（树上干杏3号）和杏5（李光杏）聚为一类，而其他5份材料[杏1（树上干杏1号）、杏4（树上干杏4号）、杏6（第四师61团古杏）、杏7（巩留野杏）、杏9（珍珠油杏）]聚为一类，说明这5份材料亲缘关系较近，具有较相似的遗传背景。

SSR标记所构建杏研究材料的指纹图谱，不受表型特征限制，也不受外部环境影响，本次杏研究材料品种（类型）的鉴定结果为：（1）杏1（树上干杏1号）、杏2（树上干杏2号）差异比较大。（2）杏1（树上干杏1号）、杏4（树上干杏4号）为一类，其遗传相似性系数为0.808。（3）与杏1（树上干杏1号）亲缘关系由近到远依次为巩留野杏、珍珠油杏、第四师61团古杏，其遗传相似性系数依次为0.711、0.692、0.673。（4）杏2（树上干杏2号）、杏3（树上干杏3号）为一类，其遗传相似性系数为0.846。（5）杏2（树上干杏2号）与杏5（李光杏）亲缘关系较近，其遗传相似性系数为0.654。（6）杏8（霍城野杏）为独立的一类，与杏1（树上干杏1号）、杏2（树上干杏2号）亲缘关系均较远。

3讨论

中亚地区原始农业的最初阶段，天山野果林的各种野生果树中野杏应该是古人驯化栽培的首选树种，其栽培品质好，含糖量高，易晒制杏干，杏干是便于贮藏的最佳果品。由此可以推论，在原始农业初期，由于自然条件适宜，人类生活需要，天山野杏曾在古代中国新疆南部乌兹别克斯坦费尔干纳及土库曼斯坦等地首先得到大量种植，然后向东扩展到中国内地，向西拓展到欧洲，但在杏的起源和栽培史中，文献和史料无此记载。从世界范围来看，杏的起源、发展、栽培和制干，除广大中亚地区，包括伊犁河谷及其西南天山的野杏，均具备晒制优质杏干的野杏资源和自然条件外，中国甘肃以东地区和哈萨克斯坦以西的欧洲，由于空气湿度大，均不具备晒制杏干的自然条件，因此，古代的东方人和西方人应该是首先见到能够经过长途贩运又具有优良品质的杏干，然后才是引种栽培[21]。鉴于树上干杏1号与巩留野杏具有较相似的遗传性判断其具有相近的亲缘关系，再次印证了树上干杏为伊犁天山野杏中选育而来的说法。至于树上干杏从伊犁河谷到乌兹别克斯坦迂回传播的过程还需进一步考证。

SSR标记所构建的杏指纹图谱，不受表型特征限制，也不受外部环境影响，不仅可用于杏品种（类型）的鉴定，还可为杏品种（类型）的杂合性鉴定提供可靠的方法。树上干杏2号与李光杏亲缘关系近，两者具有较相似的遗传背景，不排除芽变或杂交的可能性。

树上干杏3号与树上干杏2号品种归为同一类，树上干杏4号类型与树上干杏1号品种归为同一类，SSR标记反映出的亲缘关系与根据生态类型表现对杏种质的分类结果基本一致，其表型差异来源于栽培区域生态差异、土壤差别、管理或遗传等因素。

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