对香粳型水稻花药培养的探讨

刘军 吕桂兰 蒋洪波 刘博 解文孝

摘    要：以3份香粳型杂交F1代为试验材料，分别对水稻花粉发育的时期、不同培养基对绿苗率的影响进行研究。结果表明，水稻花药培养过程中，选用优异的亲本材料，才能建成高质量的培养群体;花药培养中分别加入2，4-D和NAA的培养基，前者愈伤组织质量较好，绿苗分化率高;多种激素混合使用更有利于提高花药培养能力。

关键词：诱导;分化;培养基;花药;愈伤组织;激素

文章编号：1005-2690（2021）22-0027-02       中国图书分类号：S511       文献标志码：B

我国从20世纪70年代初开始进行水稻花药离体培养的应用研究[1]。利用花药培养获得单倍体愈伤组织分化成苗获得的植株不存在显隐性问题，加倍后或获得纯合植株，缩短育种年限，加快育种进程，是一项较为实用的生物育种辅助技术[2]。在水稻花药培养中，必须有较高的出愈率和绿苗率，才能保证足够的单双倍体群体。本试验通过对取材时期、部位、不同的激素配比等进行研究，对香粳型杂交水稻育种提供帮助。

1   材料与试验方法

1.1   材料

辽宁省推广的香型品种和中间材料配制的杂交F1代材料，材料编号为L1（锦稻香106/北粳2025）、L2（隆粳香3/稻花香）、L3（F133/中科837）。

1.2   试验方法

1.2.1   样品处理

在天气晴朗的下午，选择试验材料中处于水稻孕穗期健康的幼穗，幼穗保留2叶及1节。用75%的酒精消毒，用灭菌的纱布及保鲜膜将幼穗包裹好，然后放置于4～7 ℃冰箱中预处理7～10 d。

1.2.2   接种方法

取低温处理过的幼穗，剥去多余叶片和叶鞘，剪下发育适中带枝梗的小穗，放在灭菌的烧杯中。在超净工作台上用镊子取少许小穗均匀蘸75%的碱酒精放在酒精灯上点燃，当熄灭后放到无菌滤纸的培养皿上，用剪刀从颖壳基部1/3处剪断花丝，将完整的花药抖到诱导的培养基上[3]。

1.2.3   培养条件

每个试管接种50～60枚花药，让花药平鋪在试管底部，然后放在26～28 ℃恒温箱中暗培养。当愈伤组织长至2 mm左右时转移到分化培养基上，然后放在2 000 lx光照条件下诱导分化。每天用日光灯补充光照9～10 h，培养温度控制在27～29 ℃。

1.2.4   诱导阶段培养基对愈伤组织的影响

对L1、L2、L3这3个香粳型材料F1代植株的花药进行诱导培养，分别接种到4个配方的诱导培养基上，对应编号为1、2、3、4，见表1。接种10 d后统计变色数，计算变色率，40 d后每隔5 d统计愈伤组织数，计算不同培养基的出愈率，筛选出最适合的诱导阶段培养基[4]。

1.2.5   分化阶段培养基对出苗率的影响

以L1号愈伤组织为材料，分别接种在4个不同激素的MS培养基上，培养30 d后记录分化成绿苗的数目，计算分化率。

1.2.6   统计方法

2   试验结果与分析

2.1   诱导阶段培养基对愈伤组织的影响

接种后花药变色多，对以后愈伤组织生长比较有利。由表2可知，L1材料在1号培养基上10 d变色率最高为18.9%，出愈率为6.0%;3号培养基变色率最低为8.7%;4号培养基变色率为18.5%，出愈率最高为17.3%。L2材料在4号培养基上10 d变色率最高为16.1%;3号培养基变色率最低为9.2%，但L2材料分别在4个培养基上诱导出的愈伤组织质量最差，质地松散，不结块，易老化，变成黑褐色，这可能跟亲本的基因型有关。L3材料在4号培养基上10 d转色率最高为16.6%，3号培养基变色率最低为9.4%。L1、L2、L3材料在4号培养基上都表现出较高的出愈率，分别为17.3%、15.8%、10.6%。表明4号培养基最适宜用于香粳型杂交后代材料的花药培养。

2.2   分化阶段培养基对分化率的影响

把L1号材料分别接种到4种不同激素的培养基上，接种30 d后记录绿苗数，每隔5 d调查1次，50 d后计算分化率。由表3可知，KT与2，4-D和NAA配合使用的培养基，愈伤组织的诱导率最高，供分化培养的数量也最多，但绿苗分化率却不是最高的（82.2%），其原因可能是由于较强的激素作用，促使药壁变色较快，但降低了愈伤组织的质量。单独加NAA诱导的培养基，愈伤组织质量最差，经转移分化培养后，很容易老化，变成黑褐色，很多不分化或分化出根，绿苗分化率极低。加入2，4-D的诱导培养基，愈伤组织的诱导率比NAA的稍差，但愈伤组织质量较高，经转移分化后绿苗分化率较高。这个试验结果与黑龙江省农科院水稻所的许世寰试验结果基本相似。许世寰认为生长素对花粉愈伤组织诱导频率的效应一般NAA高于2，4-D，但NAA对再分化的作用不如2，4-D好[5]。

3   结论

水稻花药培养一般要求稻穗在4～7 ℃冰箱中预处理7～10 d，叶枕间距为5～7 cm，但硬壳经常规消毒冲洗后变软，剪壳后花药粘贴在硬壳壁，很难抖落。本次试验采用75%的碱酒精代替以前的消毒方法，这样剪壳后花药很容易抖落到培养基上，操作方便，缩短接种时间，降低污染概率，减轻工作量。

水稻花药培养过程中，选用优异的亲本材料会产生定向突变并加强对目的性状的筛选，增强育种的可预见性，这是花培育种的发展方向[6]。

香粳型杂交F1代诱导阶段激素配比为2 mg/L 2，4-D、1 mg/L NAA、2 mg/L KT;分化阶段激素配比为2 mg/L 6BA、1 mg/L NAA、2 mg/L KT，培养结果是最好的。花培阶段复合激素比单一激素培养率高。这个结果与冯双华等的研究结果相同，单一激素和复合激素对试验材料花培效果的影响差异较大，单一激素培养效果较差，复合激素能提高花药的培养力。

参考文献：

[1]王万奇，李文龙，王媛媛，等.植物花药组织培养技术的研究[J].黑龙江农业科学，2015，10（10）：177-179.

[2]杨国花，陈健根，孙军华，等.浙江省新选育的杂交粳稻组合筛选研究[J].上海农业科技，2005（4）：20-21.

[3]潘国君，陈温福，冯雅舒，等.寒地水稻花培育种研究[J].沈阳农业大学学报，2003，34（5）：381.

[4]赵海岩，郑文静，邹吉成，等，现化生物技术在水稻育种上应用[J].垦殖与稻作，2005（2）：26-27.

[5]许世寰.粳稻花粉植株诱导的研究[J].黑龙江农业科学，1985（1）：11-17.

[6]季彪俊，陈启锋，黄群策，等.水稻花药培养技术的总结与探讨[J].福建农业大学学报，2001，30（1）：22-28.