PGPR菌剂在蜈蚣草修复砷污染土壤中的应用研究

袁明

摘    要：为研究PGPR菌剂对蜈蚣草修复砷污染土壤的作用，采用盆栽进行试验，在砷浓度150 mg/kg的土壤中接种PGPR菌剂，再培养蜈蚣草。研究结果表明，接种PGPR菌剂后可以促进蜈蚣草生长，土壤中总砷含量减少，显示PGPR菌剂对蜈蚣草修复砷污染土壤具有促进作用。

关键词：蜈蚣草;PGPR菌剂;砷污染土壤;修复

文章编号：1005-2690（2021）23-0022-04       中国图书分类号：X53       文献标志码：B

PGPR是植物根际促生菌，可以促进植物生长及植物对矿物质营养的吸收和利用，是能抑制有害微生物生长的有益菌类。本研究采用蜈蚣草的盆栽试验，在蜈蚣草根际施用PGPR菌剂，探讨各种PGPR菌剂对蜈蚣草砷超富集能力的影响，得到蜈蚣草与PGPR菌剂共同作用下对砷污染土壤修复效率的理论依据。

1   材料与方法

1.1   盆栽试验

将长势相近的33株蜈蚣草种植于白色塑料花盆中，每个花盆中的土样为2.2 kg，每日浇清水，前一个月每周浇灌一次植物营养液，每盆20 mL。为保持温度和湿度，在盆口包上一层保鲜膜。每个花盆中加入亚砷酸钠，使土壤中砷含量为150 mg/kg。花盆编号1～11号，做3组平行试验。

1.2   菌株接种

利用试验前期从蜈蚣草根部分离筛选获得的具有抗病促生功能的耐砷内生细菌作为PGPR菌剂[1]，包括芽孢杆菌、农杆菌、假单胞菌3种类群共12株。基于12株菌株的抗病促生能力和拮抗特性进行组合，形成PGPR菌剂（具体组合情况见表1），共10组，编号T1～T10。把菌株接种于无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30 ℃恒温振荡培养72 h（活菌数≥1×108 cfu/mL）。采用浇灌的方式将T1～T10号PGPR菌剂接种于蜈蚣草根部。每一个月重复加一次菌悬液，总共浇灌4次。以不加菌剂为空白对照（CK）。

1.3   植物收样

蜈蚣草放入光照培养室培养6个月后，将蜈蚣草从花盆中移出，冲洗干净表面的土壤，移出时避免伤害根茎，然后分开保存根系和地上部[2]。

1.4   植株生长情况测定

①测定蜈蚣草株高：从露出土壤表面的地方测定每根茎的最高点。②测定蜈蚣草叶片总数。③测定茎粗。④测定鲜重、干重。测定完鲜重后将样品在115 ℃杀菌0.5 h，然后75 ℃恒温烘干后称重。⑤将蜈蚣草地上部与根系分离，用LA-S植物图像分析仪对根系进行洗根分析，得到扫描分析后的根系数据与图片。

1.5   叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性测定

（1）酶液提取。称取蜈蚣草叶片0.25 g放入研钵中，加入50 mmol/L、4 ℃、pH值8.2的磷酸缓冲溶液，在水浴锅中研磨成浆，过滤后将滤液在4 000 r/min下离心20 min，取上清液为待测液。

（2）超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法。使用邻苯三酚自氧化法。将50 mmol/L、pH值8.2的Tris-HCl-EDTA缓冲溶液和50 mmol/L邻苯三酚溶液放在恒温水浴锅中，温度设定25 ℃。待温度保持稳定后取3 mL Tris-HCl-EDTA缓冲溶液、5μL邻苯三酚溶液加入试管中，摇匀后迅速放入比色皿中，在紫外分光光度计中测定吸光度，波长325 nm，每间隔30 s测定一次吸光度，记为A1，此为不加酶液的对照组。

重复上述操作，待Tris-HCl-EDTA缓冲溶液、邻苯三酚溶液混匀后迅速加入5 μL待测液，同样在波长325 nm处每隔30 s测定一次吸光度，记为A2。

（3）计算抑制率S（%）和酶活力性U（U/g）。

式中：V为反应液总体积（mL）;N为样品稀释倍数。

1.6   叶片中过氧化物酶（POD）活性测定

（1）酶液提取。称取0.2 g蜈蚣草叶片，然后加入20 mmol/L磷酸缓冲液5 mL，在研钵中研磨成匀浆，转入试管中并以磷酸缓冲液定容到10 mL，以4 000 r/min离心10 min，取上清液为待测酶液。

（2）反应混合液配制。取0.2  mol/L磷酸缓冲液（pH值6.0）200 mL加入0.076 mL愈创木酚搅拌溶解，冷却后加入30%的H2O2 0.112 mL，混匀后保存于冰箱中备用。

（3）测定方法。取3 mL反应混合液加入30 μL酶液，以0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH值6.0）为对照调零，而后测定OD470值（测定40 s），每30 s读数一次。

（4）酶活性计算。以每分钟OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位。计算酶活性U（U/g）。

式中：Vt为提取酶液总体积（mL）;Vs为测定时取用酶体积（mL）;W为样品鲜重（g）;t为反应时间（min）。

1.7   数据处理

试验使用Excel 2010软件对原始数据进行处理和分析，利用SPSS 17.0计算Duncan单因素方差。

2   结果与分析

2.1   蜈蚣草生物量参数

蜈蚣草生物量参数，株高、叶片数、茎粗、鲜重、干重见表2。

试验中，接种T1、T9、T10号组合PGPR菌剂的蜈蚣草与空白对照相比，蜈蚣草的植株高度、茎粗、干鲜重、叶片数都出现了一定程度的增加。接种T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8号组合PGPR菌剂的蜈蚣草，上述生物量参數出现了一定程度的减少，蜈蚣草生长受到了明显抑制，株高、茎粗、鲜重、干重、叶片数都低于空白对照组。蜈蚣草接种不同PGPR菌剂的生长情况见图1。

2.2   抗氧化酶系统

蜈蚣草超氧化物歧化酶与过氧化物酶的活性见表3。

2.3   蜈蚣草洗根分析

蜈蚣草的洗根分析如图2所示，分析数据如表4所示。对比空白对照组接种T1、T9、T10号PGPR菌剂的蜈蚣草根系的总根长、根表面积、根平均直径都有一定程度的增加，T1植株根系平均直径增长量最大。接种T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8号组合PGPR菌剂的蜈蚣草根系总长度、表面积、平均直径都有一定程度的减少。

2.4   土壤理化性质分析

土壤理化性质如表5所示。11组土壤都为酸性，对比空白对照组可知，施加PGPR菌剂会略微增加土壤的酸性。施加T1、T9、T10号PGPR菌剂还会增加土壤的有机质、速效氮、有效磷、速效钾含量。

由表5可知，土壤中的总砷含量有所降低，说明土壤中的砷部分转移到蜈蚣草地上部。與空白对照组相比，添加T1、T9、T10号PGPR菌剂的土壤中砷含量更低，T1、T9、T10号蜈蚣草从土壤中吸收的砷更多，对土壤中砷的去除效率分别提高了36.36%、9.10%、18.18%。其中，T1号菌剂的效果最好，说明施加PGPR菌剂确实可以提高蜈蚣草对砷污染土壤的修复效果。

2.5   土壤总砷含量与蜈蚣草各项生理指标的相关性分析

通过对土壤总砷含量和蜈蚣草各项生理指标进行相关性分析，采用SPSS中的双变量相关性分析方法，结果如表6所示。其中，蜈蚣草株高、叶片数、鲜重、干重、根平均直径与土壤中总砷显著负相关，即与蜈蚣草对砷的吸收量显著正相关。

3   讨论

3.1   接种不同PGPR菌剂对蜈蚣草生长情况的影响

对比不加菌剂的空白对照，添加T1、T9、T10号PGPR菌剂可以促进蜈蚣草生长，提高蜈蚣草的生物量，具体表现在蜈蚣草的株高、干鲜重、叶片数、茎粗都有明显增加。这可能是因为添加PGPR菌剂能够缓解砷对蜈蚣草的毒性，使蜈蚣草在砷胁迫环境下也能正常生长。添加T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8号PGPR菌剂的蜈蚣草生长受到抑制，上述各项生物量参数下降。

3.2   接种不同PGPR菌剂对蜈蚣草抗氧化酶活性的影响

添加T1、T9、T10号PGPR菌剂的蜈蚣草叶片的SOD、POD酶活性都比空白对照组高，添加T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8号PGPR菌剂的蜈蚣草SOD酶和POD酶活性都比空白对照组低。SOD酶和POD酶是蜈蚣草体内很重要的抗氧化酶。

研究表明，蜈蚣草在砷胁迫的环境下，会产生有毒害作用的自由基，而SOD酶可以清除有毒害的自由基，缓解砷对植物的毒害作用，POD酶能分解SOD酶作用产生的过氧化氢，消除过氧化氢对植物的氧化作用[3]。接种T1、T9、T10号PGPR菌剂能够促进蜈蚣草生长，提高蜈蚣草生物量的原因可能是T1、T9、T10号PGPR菌剂提高了蜈蚣草的SOD、POD酶活性，缓解了砷胁迫环境对蜈蚣草的毒害作用，相反T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8号蜈蚣草生长受到抑制，可能是由于对应的PGPR菌剂能会抑制SOD、POD酶活性。

3.3   接种不同PGPR菌剂对蜈蚣草根系形态的影响

对比空白对照组，添加T1、T9、T10号PGPR菌剂的蜈蚣草根系总根长、根表面积、根平均直径都有一定程度的增加，添加T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8号PGPR菌剂的蜈蚣草根系总根长、根表面积、根平均直径都有所下降。本试验中添加的PGPR菌剂对蜈蚣草根系的生长特性有所改变，其中T1、T9、T10号PGPR菌剂提高了蜈蚣草根系长度、表面积与直径，增大了根系与土壤的接触面积，有利于蜈蚣草从土壤中吸收砷。添加T1、T9、T10号PGPR菌剂能促进蜈蚣草生长、提高植株生物量，可能是因为PGPR菌剂引起蜈蚣草根系形态改变，提高根系体积与活力，可以更好地吸收土壤中的营养物质[4]。

3.4   蜈蚣草生长情况与PGPR菌剂中的菌株组合方式的关系

添加T1、T9、T10号PGPR菌剂的蜈蚣草生长情况优于空白对照组，蜈蚣草的株高、干鲜重、叶片数、茎粗都有明显增加，根系总根长、根表面积、根平均直径也有一定程度的增加。根据表1中菌株的组合方式发现，T1、T9、T10号PGPR菌剂中都有芽孢杆菌A，其余生长受到抑制的蜈蚣草中都没有接种含有芽孢杆菌A的PGPR菌剂。研究发现，芽孢杆菌有抑制病原菌生长、帮助植物提高免疫力、分泌植物激素的能力。因此，芽孢杆菌A对促进蜈蚣草生长、进一步提高砷修复有潜在价值。

3.5   接种不同PGPR菌剂对土壤理化性质的影响

试验中11组土壤都呈酸性，添加PGPR菌剂会使土壤的pH值略微下降。研究表明，蜈蚣草对酸性环境有很高的耐受性，能够在酸性很强的土壤中生长，并且在酸性条件下对砷的吸收能力更强[5]。本试验中添加PGPR菌剂，对土壤pH值的改变不明显，对蜈蚣草砷吸收能力没有影响。

添加T1、T9、T10号PGPR菌剂会增加土壤中的有机质、有效磷、速效氮、速效钾含量。研究表明，微生物通过降解、合成等各种活动可以提高土壤中的有机质和各种营养成分，导致土壤理化性质改变。

11组土壤中的砷浓度都有所降低，低于最初未种植蜈蚣草时的浓度（150 mg/kg）。添加T1、T9、T10号PGPR菌剂的土壤中砷浓度低于空白对照组，添加T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8号PGPR菌剂的土壤中砷浓度高于空白对照组。这说明添加T1、T9、T10号菌剂的蜈蚣草砷吸收能力增强，对土壤砷修复效果增强，其中，T1号PGPR效果最好。这可能是因为添加PGPR菌剂能够促进蜈蚣草生长，提高了植株生物总量，而更大的生物量意味着相同环境能富集到更多的砷。T1、T9、T10号蜈蚣草根系总长、根表面积、根平均直径增加，能帮助蜈蚣草富集到更多砷。

4   结论

通过试验可知，接种T1、T9、T10号PGPR菌剂对蜈蚣草地上部及根系的生长有促进作用，并能提高蜈蚣草修复土壤砷污染的效果，减少土壤中的总砷含量。本试验表明，PGPR菌剂在促进蜈蚣草修复砷污染土壤方面具有潜在价值。

参考文献：

[1]李韵诗，冯冲凌，吴晓芙，等.重金属污染土壤植物修复中的微生物功能研究进展[J].生态学报，2015，35（20）：6881-6890.

[2]余天红，黎华寿.砷污染土壤微生物修复机制及其研究进展[J].环境污染与防治，2014，36（12）：77-82.

[3]冯欣，刁治民，曹玲珍，等.PGPR作为微生物肥料的研究进展[J].安徽农学通报，2005，11（6）：85-87.

[4]崔岩山，陈晓晨，付瑾.污染土壤中铅、砷的生物可给性研究进展[J].生态环境学报，2010，19（2）：480-486.

[5]李有志，罗佳，张灿明，等.湘潭锰矿区植物资源调查及超富集植物筛选[J].生态学杂志，2012，31（1）：16-22.