土壤与大气双重胁迫下苋菜幼苗对铅的累积与生理响应

刘楚藩,肖荣波,黄 飞,戴伟杰,高中原,徐美丽,温小情

广东工业大学环境科学与工程学院, 广州 510000

铅(Pb)是最常见的有毒元素之一,由于其不可降解性,且在土壤、空气和水资源中分布广泛,严重威胁着生态环境与人体健康。土壤污染和根系吸收被普遍认为是农作物Pb的主要来源[1- 2],但是针对大气沉降对作物胁迫效应的研究相对较少。大气沉降作为区域土壤重金属积累的主要途径,对农作物特别是叶菜类蔬菜的影响不容忽视[3]。大气沉积物中的Pb具有更强的生物活性[4],它能通过叶表皮、气孔、水孔等途径被作物叶片吸收并转移到其他部位,可显著增加作物Pb含量[5-6]。伴随着城镇化与工业化发展,汽车尾气、燃煤燃烧以及各类工业区建设等导致大气Pb含量升高[7],使得许多地区农作物会受到大气、土壤等多污染源重金属的共同胁迫[8],但其重金属累积和生长生理响应尚未受到足够重视,不利于区域重金属污染综合防治和农作物安全。

苋菜(AmaranthustricolorL.)作为典型的叶菜类蔬菜,在我国南方地区广泛种植[9],且对重金属有较强富集能力,易对人体健康产生潜在危害[10- 11]。苋菜生长周期较短(60 d左右),耐受性较强,是理想的试验作物。考虑到重金属大气沉降中湿沉降部分占比大,且生物有效性更高,更易被植物吸收[12- 13],参照其它研究采用喷洒重金属溶液的方式模拟大气重金属沉降[14- 15]。因此,本文选取苋菜作为供试作物,以典型南方红壤为供试土壤,并模拟了南方酸性湿沉降(pH=5)。通过室内盆栽试验,研究了不同浓度土壤与大气沉降胁迫下,苋菜幼苗体内重金属Pb的累积、化学形态以及幼苗生长和生理响应。以揭示大气沉降-土壤双重胁迫下蔬菜对重金属Pb吸收累积和生理响应特征,为多环境介质重金属污染综合防治和农产品安全生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

从韶关市曲江区樟市镇(113.472199°E,24.555156°N)采集农田表层土(0—20 cm)作为供试背景土壤,土壤性质如表1所示。土壤去除大颗粒杂质,自然风干,混匀,过1 cm×1 cm筛。为增加土壤养分,向每千克风干土壤中添加0.26 g KH2PO4和2.9 g NH4NO3,以溶液的形式与土壤充分混匀[16- 17]。选取华南地区常见的作物-柳叶苋菜(AmaranthustricolorL.)为供试作为供试植物(购自武汉田园大丰农业科技有效公司),供试盆栽容器为直径15 cm、高度为11 cm的塑料盆。Pb的污染物为Pb(NO3)2分析纯化学试剂(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

表1 土壤性质

1.2 盆栽模拟实验

实验设计考虑大气沉降与土壤两个因素,分别设置空白、低、高三个浓度梯度(表2)。

其中土壤浓度设置参考了农用地土壤污染风险管控值(GB15618—2018)以及采矿、冶炼等高污染区域农田Pb含量[18- 19]。模拟大气沉降参照现有大气重金属沉降的研究结果[20- 21],按照Pb大气沉降通量污染程度,分别设置为空白0 mg m-2d-1、低污染0.3 mg m-2d-1、高污染3 mg m-2d-1,换算为喷洒液浓度分别为0、0.71、7.1 mg/L。为显著区分不同胁迫浓度对植物的影响,土壤和喷洒Pb溶液浓度梯度设置了较大跨度。向预处理后的土壤中加入不同浓度的Pb(NO3)2溶液,充分搅拌均匀后平衡两个月。Pb(NO3)2外源添加的N含量仅为NH4NO3的5%—10%,与空白组相比由Pb(NO3)2中N对植物造成的影响可忽略不计[16]。苋菜种子在多菌灵溶液中浸泡消毒,播种于装有不同浓度土壤的塑料盆中。每个盆栽保持适当间距,待苋菜发芽后每3 d向对应的处理组(约0.2 m2)喷洒不同浓度的Pb(NO3)2溶液(pH=5)模拟Pb大气沉降,空白组为稀HNO3溶液(pH=5)。每次250 mL(分为3次,每4h 1次),共喷洒5次,喷洒溶液时用塑料薄膜对其它处理组进行遮挡,防止相互影响。各处理组设置3个平行样品,共27盆。盆栽实验在温室中进行并暴漏在自然光照下,早晚各浇水一次保持土壤湿润,发芽后15 d采集苋菜幼苗样品。

表2 实验设计

1.3 植物样品采集与分析

待苋菜发芽后15 d采集植物样本,用去离子水洗涤以去除附着在植物表面的杂质,后自然风干。记录植物样品鲜重、株高和根长,样品在70 ℃下干燥至恒重后记录干重。耐受指数由公式1计算[22],含水率由公式2计算。

耐受指数 (%) = (根长Pb胁迫组/根长对照组) × 100

(1)

含水率 (%) = (1-干重 /鲜重) × 100

(2)

1.3.1植物Pb含量与化学形态的测定

将收获的植株浸泡在20 mmol Na2-EDTA溶液中20 min,去除吸附在蔬菜表面的Pb,后用去离子水冲洗。Pb的化学形态采用植物鲜样测定,Pb总量采用植物干样测定。参照朱光旭等人的方法用五种萃取剂依次提取植物体内Pb的化学形态[23]。采用混合酸HNO3和HClO4(4∶1)消解所有植物样品,采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES, iCAP 7000, Thermo Fisher Scientific, USA)测定样品Pb含量。

1.3.2植物生理指标的测定

植物体内的可溶性蛋白、过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)、抗坏血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性均采用生物试剂盒测定(购自南京建成生物工程研究所有限公司)[24]。新鲜植物样品用预冷的磷酸缓冲液(pH=7.3)研磨,匀浆液在2500 r/min离心15 min,取上清液测定上述指标,整个实验在4 下进行。

1.4 数据分析

实验数据为三个平行独立实验的平均值±标准差。所有实验数据用SPSS软件进行统计分析,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD多重比较(P<0.05)分析不同处理组间的差异。采用2×3的双因素方差分析(two-way ANOVA)分析土壤与大气Pb胁迫对植物的影响程度。采用SPSS软件进行主成分分析(PCA)和皮尔逊相关分析。

2 结果与讨论

2.1 土壤与大气胁迫下Pb在苋菜幼苗体内的累积与化学形态

植物Pb含量随土壤和大气浓度的增加而上升,与对照组相比高浓度土壤和大气单组胁迫组植物Pb含量分布增加了64.91 mg/kg和45.74 mg/kg(图1)。土壤和大气共同胁迫对植物Pb含量均有明显提升作用,并在HSHA处理组达到最大值141.27mg/kg。双因素方差分析结果表明(表3),土壤和大气胁迫浓度对植物Pb含量均存在显著影响(P<0.05),其中土壤胁迫浓度对植物Pb含量的影响较大占62.64%,大气胁迫浓度影响较小占32.89%,且两者之间存在交互作用(P<0.05)。由此可推断土壤与大气双重污染源胁迫下植物中的Pb主要来源于根系对土壤中Pb的吸收,大气沉降对植物Pb含量的贡献较小,但不容忽视。同一土壤浓度下,高、低浓度大气沉降都能有效增加植物Pb含量。大气沉降中的Pb可以直接或间接地进入植物体内,沉积在叶片上的Pb通过叶片表皮、角质层和气孔直接进入植物叶片组织,而沉积在土壤中的Pb则通过根系吸收间接进入植物[25]。双因素方差分析在重金属源分析方面存在一定局限性,后续研究会采用同位素技术更精确的分析不同污染源对植物中Pb的贡献率。

图1 不同浓度土壤和大气胁迫下苋菜幼苗体内铅的含量和化学形态Fig.1 Chemical forms and content of Pb in Amaranthus tricolor L. seedlings under different concentrations of soil and atmospheric stresses数据为平均数±标准差(n=3),不同小写字母分别表示各处理之间有显著差异(P<0.05); CK：对照组;LS：低浓度土壤胁迫;HS：高浓度土壤胁迫;LA：低浓度大气胁迫;HA：高浓度大气胁迫;LSHA：低浓度土壤高浓度大气共同胁迫;HSLA：高浓度土壤低浓度大气共同胁迫;LSLA：低浓度土壤低浓度大气共同胁迫;HSHA：高浓度土壤高浓度大气共同胁迫

表3 苋菜幼苗Pb含量双因素方差分析结果

植物中的重金属以不同的化学形态存在,具有不同的迁移能力和生物毒性。萃取剂的极性越强,其对应的重金属形态迁移能力越弱,对植物的毒性越小[26]。在本研究中(图1),不同浓度土壤和大气胁迫下植物体内Pb的化学形态以盐酸提取态(37%—64%)为主,其次为醋酸提取态(10%—25%)、氯化钠提取态(6%—17%)和水提取态(8%—16%),其他形态较少。一些研究者在宿根花卉和菊科植物中也发现类似分布规律[23,27]。这一现象说植物中的Pb主要与不溶性磷酸盐和不溶性草酸盐结合,这有利于减小Pb的生物有效性,减轻其对植物的毒害作用[28]。与对照组相比,植物Pb乙醇提取态比例在土壤与大气单独胁迫下均下降了10%,土壤和大气的共同胁迫作用更加明显,LSHA、HALA、LSLA、HSHA四个处理组Pb乙醇提取态比例都下降到只剩1%。同时植物Pb盐酸提取态比例随土壤和大气胁迫浓度增加而提高,在HSLA和HSHA处理组达到最大,为对照组的3.25倍。土壤和大气胁迫使得植物中的Pb从无机态和水溶态等高活性化学形态向不溶性草酸盐等低毒性化学形态转变,这可能是因为植物体内含量大量的蛋白质和多糖等物质,其表面丰富的羟基、羧基、氨基、醛基、巯基等官能团和磷酸盐能为Pb离子提供配体,从而减弱Pb在植物体内的迁移能力和毒性[29- 30]。

2.2 土壤与大气胁迫下Pb对苋菜幼苗生长的影响

生长参数是评价植物对环境污染响应的最佳指标之一。植物的株高、鲜重、干重在Pb胁迫下表现出相似的规律,大气单独胁迫(LA、HA处理组)对植物的生长表现为促进作用,其他土壤胁迫和土壤大气共同胁迫处理组均为抑制作用(表4)。植物的鲜重和干重在HSHA处理组达到最小值,与对照组相比分别减少了53.8 mg和4.37 mg。植物根长和耐性指数在高浓度土壤胁迫下(HS、HSLA、HSHA处理组)减小(11%—22%),大气单独胁迫下(LA、HA处理组)增加(22%—33%),其他处理组变化不明显。植物含水率在各实验组间无显著变化。植物对重金属的耐受程度可以通过耐受指数来反映,当其大于50%时说明植物对该重金属有较强的耐受性[31],本实验中耐受指数最小值为77.78%,说明苋菜幼苗在此Pb胁迫环境下生长良好。双因素方差分析结果表明多源胁迫下植物的生长参数(除含水率外)主要受到土壤Pb浓度的影响,大气沉降影响不显著(表5)。大气单独胁迫下(LA、HA处理组)植物生长参数都高于对照组,这可能是因为沉降在土壤中的Pb含量较低,对植物生长发育有促进作用。在他人的研究中Pb对类芦、中华常春藤和紫茉莉的生长也表现为低浓度促进高浓度抑制作用[32- 34]。HS与HA处理组植物Pb含量没有显著性差异,但HS组鲜重远低于HA组。这可能是因为HS组植物中的Pb全部来源于根部从土壤吸收,并在根部大量累积,而HA组大气沉降中的Pb可通过植物叶片吸收更多的储存于地上部分。HS组高浓度Pb对根细胞造成氧化损伤,影响植物吸收水分和营养元素,从而抑制植物的生长发育[35]。

表4 土壤和大气沉降Pb胁迫对苋菜幼苗生长的影响

2.3 土壤与大气胁迫下苋菜幼苗对Pb的生理响应

表5 苋菜生长参数双因素方差分析结果

图2 土壤和大气中Pb对苋菜幼苗生理指标的影响Fig.2 Influence of Pb in soil and atmosphere on physiological indexes of Amaranthus tricolor L.数据为平均数±标准差(n=3),不同小写字母分别表示各处理之间有显著差异(P<0.05);MDA：丙二醛 Malondialdehyde；SOD：超氧化物歧化酶 Superoxide Dismutase；POD：过氧化物酶 Peroxidase；CAT：过氧化氢酶 Catalase；AsA：抗坏血酸 Ascorbic Acid；GSH：谷胱甘肽 Glutathione

SOD能将超氧阴离子转化为H2O2和O2,是植物抗氧化系统的第一道防线,此外POD和CAT在植物细胞清除H2O2中也起重要作用[41]。在本研究中(图2),SOD活性随土壤和大气浓度先增加(29%—34%)后下降(10%—13%),但都高于对照组。POD活性随土壤和大气浓度上升而增加(16%—50%),在高浓度土壤胁迫(HS、HSLA、HSHA处理组)下达到最大活性。CAT活性在Pb胁迫下也都有所增加(35%—49%)。其他研究发现Pb胁迫对荞麦、印度苋菜和鱼腥草体内抗氧化酶的活性同样具有提高作用[35,42- 43]。Pb胁迫下植物通过提高三种抗氧化酶活性清除过量的超氧自由基和H2O2保护细胞免受活性氧侵害,SOD活性降低的原因可能是H2O2与酶的相互作用或Pb离子与其活性位点的结合导致失活[35]。POD和CAT在Pb胁迫下表现出相似的响应模式,说明它们在清除H2O2方面可能具有协同效应,从而降低植物的氧化损伤。AsA含量随土壤和大气浓度增加而上升(25%—69%),相比于大气沉降,土壤胁迫下植物AsA含量增加更为显著(图2)。植物GSH含量在土壤与大气单独胁迫下均无明显变化,但土壤与大气共同胁迫对GSH含量提升作用显著(40%—71%)(图2)。AsA和GSH是植物细胞中重要的氧化还原因子,通过清除活性氧调节植物的氧化应激反应,维持氧化还原平衡。AsA和GSH含量的增加可以促进植物细胞AsA-GSH循环,加速H2O2的清除[42]。同时,GSH中的巯基(-SH)作为高效电子供体/受体能与重金属结合形成螯合物。GSH在植物螯合素(PCs)的合成中也起着重要的作用,植物螯合素可以与重金属结合并以络合物的形式转移到液泡中,降低Pb的毒性[44]。

2.4 土壤和大气Pb胁迫与苋菜幼苗响应参数相关性

为进一步研究不同浓度土壤和大气胁迫下植物对Pb的累积和响应,对植物Pb含量、生长参数和生理指标进行了主成分和Pearson相关性分析。如图3和表5所示,前两个主成分共解释了80.92%的总方差,其中PC1占58.58%,PC2占22.35%。土壤浓度与植物Pb、MDA、AsA、GSH含量和POD活性呈显著正相关(P<0.05),说明植物体内Pb含量随土壤浓度增加,同时植物受到氧化胁迫程度增加,细胞膜受损。植物鲜重、干重、株高与可溶性蛋白含量呈显著正相关(P<0.05),说明植物蛋白对其生长发育有重要作用。高、低浓度的大气胁迫对植物的生长都表现为促进作用,这可能是因为大气喷洒Pb溶液浓度较低,而低浓度的重金属胁迫能促进植物生长。大气浓度与植物Pb含量、生长参数和生理指标相关性较低,说明大气沉降对植物的影响较小。主成分分析还区分了不同Pb胁迫对植物的影响,其中LA、HA处理组影响相似,LS、LSLA、LSHA处理组影响相似,HS、HSLA、HSHA处理组影响相似,所有处理组均与对照组显著不同。说明土壤和大气Pb胁迫对苋菜幼苗的Pb含量和生长发育都有显著影响,其中土壤胁迫的影响较大,而大气胁迫的影响有限。

图3 土壤和大气Pb胁迫与苋菜幼苗响应参数的主成分和相关性分析Fig.3 Principal components and correlation analysis of response parameters of Amaranthus tricolor L. seedlings to Pb stress in soil and atmosphere*表示在0.05水平上显著相关

3 结论

在模拟的土壤-大气Pb胁迫环境下,苋菜幼苗Pb含量不仅受到土壤重金属的影响(62.64%),也受到大气胁迫的重要影响(32.89%)。苋菜幼苗体内的Pb通过与不溶性草酸盐结合,降低值Pb的迁移能力和毒性,从而提高植物对Pb的耐受程度。苋菜幼苗体内抗氧化酶活性增加和AsA-GSH循环同样在植物Pb解毒的过程中起到了重要作用。Pb大气沉降促进了苋菜幼苗的生长和可溶性蛋白的合成,而土壤Pb胁迫都起到了抑制作用,植物对Pb的生理生化响应与土壤浓度有关。由此可见,在矿山、冶炼厂、燃煤电厂等周边区域,农作物环境安全不仅受到土壤Pb污染的影响,大气沉降污染也不容忽视。对于这些大气和土壤重金属共同胁迫的地区,农作物环境风险评价以及污染防治应考虑多介质污染源的影响。

表6 主成分分析结果