透明质酸微生物生产关键技术研究

透明质酸(hyaluronic acid，HA)，最先由美国哥伦比亚大学的Karl Meyer等人于1934年从牛眼玻璃体中提取分离得到，为N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸通过β-1，4和β-1，3糖苷键反复交替连接而成的高分子聚合物，被认为是唯一几乎存在于从细菌到人类及所有动物体之中的黏多糖。HA因其高度的黏弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性，在医药、化妆品、食品领域中广泛应用。微生物发酵法是目前HA产品的主要生产方法。

近年来，研究者针对HA发酵菌株合成效率低、发酵产率低、产能小等生物合成问题，通过菌种诱变选育、基因编辑、代谢工程改造、代谢组学分析、发酵工艺优化等方面的深入研究建立了HA高效生物制备技术。如吴祥坤（2016）等从菌种的选育、发酵过程优化和分离提取工艺条件入手获得中等相对分子质量HA。其以实验室保藏的兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus SL-2)为出发菌，利用等离子体诱变系统，筛选获得一株产中等相对分子质量HA的优良菌株XKW-104。汤栋（2015）等以马疫链球菌MF003为出发菌，通过H2O2氧化胁迫培养、紫外辐照(UV)和硫酸二乙酯(DES)对菌株进行复合诱变，获得一株高产、高相对分子质量透明质酸酶缺陷菌株ZD-25。经摇瓶发酵培养,该菌株透明质酸产量（质量浓度）达到1.61 g/L,相对分子质量达到2.13×106,分别比原始菌株提高了120.5%和57.8%。经5 L发酵罐初步发酵，突变株ZD-25的透明质酸产量（质量浓度）达到4.26 g/L,相对分子质量达到2.90×106，分别比原始菌株提高了166.3%和93.3%。Sheng（2015）等用乳酸链球菌素诱导的NICE系统构建HA合成操纵子，在乳酸菌Lactococcus lactis中打通了HA合成路径。中国专利CN201280048001.2涉及登录号为KCTC 11818BP的停乳链球菌ID9103菌株和包含对所述菌株进行培养的步骤的透明质酸生产方法，该发明的菌株能够以高产率生产高附加值的超高相对分子质量透明质酸，并且根据培养基的组成能够生产各种超高相对分子质量透明质酸，以及生产最高具有10 000 000以上的平均相对分子质量的超高相对分子质量透明质酸。CN201710485218.4公开了一种马链球菌兽疫亚种SXY36及在发酵生产透明质酸中的应用，该SXY36经紫外线、微波和γ射线照射诱变选育，无溶血性，HA发酵产率高，遗传稳定，在优选的发酵条件下，摇瓶发酵产率（质量浓度）可达0.731 g/L，发酵罐发酵的产率（质量浓度）可达4.78 g/L；采用两段变温发酵和稳定pH法，可以发酵制备高相对分子质量HA，相对分子质量可达1.89×106；采用发酵液自酶降解法制备不同相对分子质量HA，控制酶解时间，即可生产相对分子质量在3.5×104～1.89×106的HA。CN201310597818.1公开了一种高效重组表达透明质酸酶的方法，其通过在重组透明质酸酶基因N端添加一段编码组氨酸的核苷酸序列，不仅简化了透明质酸酶的纯化步骤，同时实现了重组透明质酸酶的高活性分泌表达，活性达到了21 333.33 U/mL。CN202011150607.X公开了一种透明质酸的生产方法，步骤如下：将马疫链球菌活化培养；将活化后的马疫链球菌接种到种子培养基中，在35～40℃、200～300 r/min条件下培养8～14 h；将副干酪乳杆菌接种到种子培养基中，在36～38℃的条件下培养12～24 h；将马疫链球菌种子液和副干酪乳杆菌种子液接种到发酵培养基，在30～33℃，150～250 r/min条件下发酵培养8～10 h，再在35～38℃，300～500 r/min条件下继续发酵9～12 h，得到含有透明质酸的发酵液。其将马疫链球菌和副干酪乳杆菌进行共同发酵，副干酪乳杆菌可以抑制发酵体系中透明质酸酶的活性，保证了发酵液中透明质酸的活性和产量。CN201410467077.X公开了一种产透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法，采用兽疫链球菌来源的透明质酸合酶hasA和枯草芽孢杆菌来源的UDP-葡萄糖脱氢酶tuaD，分别置于组成型启动子GAP和TEF1下表达，在毕赤酵母GS115中实现了透明质酸的生产。

综合运用基因工程和代谢工程学等方法，进一步开展异源宿主生产HA的研究，建立一套高效、稳定且安全的微生物发酵方案来获得符合人们不同需求的特定相对分子质量HA；构建HA高效交联、乙酰化、巯基化等精准结构修饰技术体系，实现HA全产业链产品研制，将是未来行业人员的研究重点。