龙眼多糖与燕麦多糖的结构特征及其益生活性比较

王轶帆，邓媛元，张 雁，魏振承，刘 光，唐小俊，王佳佳，廖 娜，张名位*

（1 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 农业农村部功能食品重点实验室广东省农产品加工重点实验室 广州 510610 2 华南师范大学脑科学与康复医学研究院 广州510631）

人体肠道内存在着大量的微生物，对于人体健康有着极大的影响。定植于肠道的有益菌构成黏膜屏障参与代谢，产生有益于人体的代谢产物，促进人体健康。通过直接食用有益菌（益生菌）或者其发酵底物（益生元），可以起到改善肠道微生态，促进肠道健康的作用。大量研究发现大多数益生元属于碳水化合物[1]，其中植物源性多糖类来源广泛、毒副作用小[2]，对肠道菌群有着积极作用，在功能食品和临床中显示出广阔的应用前景。植物活性多糖按其单糖组成可分为同多糖和杂多糖2种类型，前者由相同的单糖残基组成，后者由不同的单糖残基组成。龙眼又名桂圆，是亚热带特色代表性水果，是国家卫计委公布的药食同源原料之一。从龙眼果肉中提取的龙眼多糖（Longan polysaccharide，LP）是一种由葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖等多种单糖组成的典型杂多糖。燕麦（oat）是全价营养谷物，从燕麦麸皮中提取的燕麦多糖（Oat polysaccharide，OP）的主要成分为葡萄糖单糖组成的β-葡聚糖，具有降低血清胆固醇、降血糖和促进益生菌增殖等功能[3-4]。

以龙眼多糖和燕麦多糖为杂多糖和同多糖的代表性材料，比较2 类多糖的益生活性，解析其结构基础与多糖益生活性的构效机制，对指导高活性益生元产品开发具有重要意义。目前龙眼多糖生理功能研究主要集中在抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等方面，而对其益生活性的研究报道较少。Chaikham 等[5-6]研究发现龙眼汁能显著促进双歧杆菌、干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌增殖，减少人肠道微生物生态模拟系统中的致病菌。研究早已证明燕麦β-葡聚糖具有调节肠道菌的作用，如：Mälkki等[7]发现β-葡聚糖发酵产生的短链脂肪酸（Short chain fatty acids，SCFA）为结肠细胞提供能量，修复结肠上皮细胞的损伤，在小鼠体内能够促进双歧杆菌和乳酸杆菌的增殖，并抑制大肠杆菌，且分子质量低的β-葡聚糖对肠道益生菌增殖作用更明显[8]。多糖大多具有促进肠道益生菌增殖的作用，不同的种类多糖的益生活性不尽相同。

研究表明，多糖的益生活性与其单糖组成等结构特征有着一定的相关性[9]。目前对多糖的结构及益生活性的研究通常就某一种多糖独立展开。龙眼多糖是一种组分复杂的杂多糖，燕麦多糖是以β-葡聚糖为主的同多糖。对比以龙眼多糖为代表的杂多糖和以燕麦多糖为代表的同多糖的益生作用差异，分析结构与益生活性的关系还鲜见报道。本文以2 种多糖的益生效果为切入点，对比它们的理化性质、结构特征，分析其益生活性差异的原因，旨在为以全谷物和水果为原料开发的营养代餐食品或功能性健康食品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

龙眼果干购于广东省高州晟丰水果专业合作社；燕麦麦麸购于张家口莜芽食品有限公司；干酪乳杆菌（Lactobacillus casei GIM1.410）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus GIM 1.731）、植物乳杆菌植物亚种 （Lactobacillus plantarum subsp.plantarum GIM 1.380）及粪肠球菌（Streptococcus faecalis GIM 1.389）购自广东省微生物菌种保藏中心。半乳糖醛酸，Toronto Research Chemicals；α-淀粉酶、盐酸羟胺、吡啶、醋酸酐、右旋糖酐等，美国Sigma 公司；氨基酸混合对照品，美国Agilent公司；考马斯亮蓝，南京建成生物工程研究所；其它试剂均为国产分析纯级。

1.2 仪器和设备

UV-1800 紫外可见分光光度计，日本岛津公司；Agilent 6890GC/5973 气相色谱仪/质谱联用仪，美国Agilent 公司；Agilent 1260 Infinity 高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；S-3700N 扫描电子显微镜，日本日立公司；AR1500EX 流变仪，美国TA 公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的制备

1.3.1.1 龙眼多糖的制备 在Yang 等[10]的龙眼多糖提取方法上有所改动。称取一定量龙眼干，加入80%乙醇浸泡过夜，用榨汁机打浆获得龙眼果肉浆，4 000 r/min 离心3 min，收集沉淀。沉淀按料液比1∶20 加入蒸馏水，80 ℃水浴浸提4 h，用纱布趁热过滤，收集上清液。溶液在60 ℃旋蒸浓缩至原来体积的1/5，获得多糖溶液。加入1/4 体积的Sevag 试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1），磁力搅拌20 min后，4 000 r/min 离心15 min，脱除蛋白质，重复3次，直至基本无蛋白，收集上清液。旋蒸浓缩多糖溶液到原体积的1/4，向多糖溶液中逐渐加入乙醇，使体系中乙醇最终体积（φ）达到80%，4 ℃静置过夜，抽滤获得沉淀。沉淀加入蒸馏水溶解后再冷冻干燥得到粗多糖。

1.3.1.2 燕麦多糖的制备 参考张民等[11]的燕麦多糖提取方法，称取一定量的燕麦麦麸，按料液比1∶17 加入蒸馏水，按溶液总体积加入20 U/170 mL的α-淀粉酶，常温反应20 min。70～75 ℃水浴浸提2 h，纱布趁热过滤，收集上清液。待上清液温度降低，按溶液体积加入50 U/100 mL 的α-淀粉酶，反应25 min 后，将上清液在60 ℃旋蒸浓缩至原来体积的1/5，取一定量的浓缩液加入1/4 体积的Sevag 试剂，后续操作与龙眼多糖提取方法相同。

1.3.2 益生菌的培养及测定 参考Wichienchot等[12]的方法，按1%质量分数浓度分别加入葡萄糖、菊粉、龙眼多糖、燕麦多糖至无碳源MRS 培养基振荡溶解，高压灭菌。分别取干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌及粪肠球菌接种于10 mL 灭菌的MRS 培养基中，接种量1%，培养12 h。再取1 mL 活化过的菌液，摇匀，加入9 mL 灭菌生理盐水稀释至106CFU/mL，取100 μL 分别接种于10 mL 添加不同碳源液体的培养基中，在兼氧条件下37 ℃恒温培养箱中培养48 h 和72 h。

1.3.2.1 菌落计数 采用平板计数法。用无菌生理盐水将样品稀释至一定稀释度，涂布平板，每个样品涂布3 个平板，培养48 h 进行菌落计数。每毫升培养液中的菌数=3 个平板培养基菌落总数/3×10×培养液的稀释倍数

1.3.2.2 pH 值测定 在0，48，72 h 分别取样2 mL，用pH 计测定。

1.3.3 多糖样品含量和组成测定 多糖含量采用苯酚-硫酸法[13]测定；糖醛酸含量采用间羟基联苯比色法[14]测定；还原糖含量用DNS 比色法测定[15]；蛋白质含量用考马斯亮蓝试剂盒测定。

1.3.4 多糖样品单糖组成测定 参考黄晓兰等[16]的测定方法，取水解后的多糖，蒸干水分，加入70 mg 盐酸羟胺，5 mL 吡啶，于90 ℃水浴加热1 h；取出稍冷，加入5 mL 醋酸酐，再于90 ℃水浴加热1 h；冷却，加10 mL 水破坏醋酸酐，用氯仿萃取乙酰化产物，萃取液浓缩定容至1 mL，进行GC-MS 分析。色谱条件：SE-30 （15 m×0.2 mm×0.33 μm）石英毛细管柱，初始柱温100 ℃，以10 ℃/min 程序升温至280 ℃，保持10 min。载气He，柱前压70 kPa，分流比10∶1，溶剂延迟2min，进样量1.0 μL。EI 离子源，电子能量70 eV，四极杆温度150 ℃，离子源温度230 ℃，电子倍增器电压1 900 V，GCMS 接口温度280 ℃，质量扫描范围29～500 u。

1.3.5 氨基酸组成测定 参考高效液相色谱-荧光法[17]，取适量多糖加6 mol/L 的盐酸（约4 mL）置于安瓿瓶中，封口，放入恒温烘箱于110 ℃水解反应约10 h，冷却，再把安瓿瓶中的样品用水转移至蒸发皿中，蒸干，残渣用水溶解定容50 mL，摇匀，过滤，滤液进行HPLC-FLD 分析。色谱条件：AgilentHPH-C18 （2.5 μm，4.6 mm×100 mm）色谱柱，柱温40 ℃；流动相A∶甲醇∶乙睛∶水，体积比为9∶9∶2；流动相B：终浓度为10 mmol/L 的Na2HPO4和NaBO3溶液（pH=8.2）；流速：1.2 mL/min；荧光检测器（一级氨基酸：激发波长=340 nm，发射波长=450 nm；二级氨基酸：脯氨酸，激发波长=266 nm，发射波长=305 nm）。

1.3.6 相对分子质量分布分析 取100 mg 多糖样品，加流动相10 mL 溶解，室温静止过夜，经0.45 μm 滤膜过滤，滤液注入凝胶色谱仪分析。色谱条件：TOSOH TSK gel G5000PWXL 和TSK G4000PWXLTSK 和G2000SWXL 串联，流动相：终浓度为25 mmol/L 的Na2HPO4和NaH2PO4缓冲盐溶液，含有0.05%的NaN3；流速：0.7 mL/min；示差折光检测器，恒温30 ℃；进样量：100 μL。使用Agilent GPC 数据分析软件，根据样品的出峰时间在校正曲线上求得多糖峰的平均分子质量及其分布[18]。

1.3.7 扫描电镜观察[19]取2 mg 多糖粉末样品，分别粘于实验台的导电胶上，用洗耳球吹去浮样，真空喷金，用S-3700N 扫描电子显微镜观察，在200 倍、500 倍、5 000 倍下拍照。

1.3.8 多糖溶液流变性测定[20]

1.3.8.1 质量分数对溶液流体性能的影响 分别配制质量分数0.5%，1.0%，3.0%的多糖溶液，测定条件温度25 ℃，椎板60 mm，2°，测定采用流动模式，以剪切速率为变量，变量范围0.1～1 000 s-1，变量扫描为线性模式，采集50 个变量点。

1.3.8.2 温度对糖溶液流体特性的影响 分别配制质量分数0.5%，1.0%，3.0%的多糖溶液，测定多糖水溶液的黏度受温度的影响曲线。测定条件为：椎板60 mm，2°，测定为流体模式，数据获取为温度递增模式，扫描范围从10～80 ℃，在10 min 内完成，采集50 个变量点，控制变量为剪切速率500 s-1。

1.3.9 数据处理及分析 采用SPSS 19.0 软件，组间差异LSD 检验分析，P＜0.05 表示差异显著。试验结果用均数±标准差表示，每组试验重复3 次。

2 结果

2.1 龙眼多糖和燕麦多糖的体外益生活性

2.1.1 不同碳源对4 种益生菌增殖情况的影响龙眼多糖和燕麦多糖对干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌及粪肠球菌的促增殖作用如表1所示。培养48 h，2 种多糖培养基的活菌数均增加，且龙眼多糖培养基中各益生菌的活菌数均大于燕麦多糖培养基中各益生菌的活菌数，具有显著性差异（P＜0.05）；培养72 h，龙眼多糖培养基中嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌活菌数下降，干酪乳杆菌活菌数增加，燕麦多糖培养基中嗜酸乳杆菌活菌数下降，干酪乳杆菌、植物乳杆菌和粪肠球菌活菌数则保持稳定。

表1 不同碳源对益生菌增殖的影响【lg（CFU/mL）】Table 1 Effects of different carbon sources on the proliferation of probiotics【lg（CFU/mL）】

2.1.2 不同碳源对4 种乳杆菌生长过程中培养基pH 值变化的影响 4 种益生菌在不同碳源培养基中培养48 h 和72 h 后，培养基的pH 值变化如图1所示。经过48 h，葡萄糖、龙眼多糖培养基pH值明显下降，而对空白对照和菊粉、燕麦多糖的培养基的pH 值改变不明显。72 h 后，各培养基pH值无明显变化。

图1 干酪乳杆菌（a）、嗜酸乳杆菌（b）、植物乳杆菌植物亚种（c）及粪肠球菌（d）的pH 值变化Fig.1 The change of pH value about Lactobacillus casei （a），Lactobacillus acidophilus （b），Lactobacillus plantarum subsp.plantarum （c）and Streptococcus faecalis （d）

2.2 龙眼多糖和燕麦多糖的化学组成

龙眼多糖和燕麦多糖的总糖含量、蛋白质含量、糖醛酸含量及还原糖含量如表2所示。龙眼多糖和燕麦多糖的总糖含量分别为61.2%和68.3%；2 种多糖蛋白质含量均较低，分别为2.2%和2.9%；龙眼多糖、燕麦多糖的糖醛酸含量分别为10.1%和5.9%；龙眼多糖、燕麦多糖中还原糖含量分别为16.0%和5.4%，龙眼多糖中糖醛酸、还原糖的含量均高于燕麦多糖。

从GC/MS 面积归一化法测定结果来看，2 种多糖的单糖组成相同，但龙眼多糖主要由葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖组成，燕麦多糖主要由葡萄糖和少量甘露糖等其它单糖组成。

2 种多糖中水解的氨基酸总量差异不大。2 种多糖中均检测出16 种氨基酸，及缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸5 种人体必需氨基酸。龙眼多糖中主要氨基酸是谷氨酸、精氨酸。燕麦多糖中主要是谷氨酸和天冬氨酸。

表2 龙眼多糖（LP）和燕麦多糖（OP）的化学组成（%）Table 2 The chemical composition of longan polysaccharide （LP）and oat polysaccharide （OP）（%）

2.3 龙眼多糖和燕麦多糖的相对分子质量分布

凝胶色谱分析结果见图2。根据多糖的出峰时间在校正曲线上求得多糖峰的平均分子质量及其分布，龙眼多糖的分子质量分布较宽，分子质量为6.38×106u；燕麦多糖是由2 个分子质量较集中的多糖组成，分子质量分别为5.42×103，2.45×106u。

图2 龙眼多糖（a）和燕麦多糖（b）的凝胶渗透色谱图Fig.2 GPC profiles of longan polysaccharide and oat polysaccharide

2.4 龙眼多糖和燕麦多糖的形态学观察

2 种多糖不同放大倍数的扫描电镜图像如图3所示。在低倍率下（200×，500×），龙眼多糖呈片状结构表面光滑；燕麦多糖呈片状结构表面粗糙，有网孔结构。在高倍率下（5 000×），可见龙眼多糖表面呈现不规则孔状；燕麦多糖呈现分散的颗粒状。

图3 龙眼多糖（a-c）和燕麦多糖（a′-c′）的多糖试样SEM 像Fig.3 SEM images of polysaccharide sample of longan polysaccharide （a-c）and oat polysaccharide （a′-c′）

2.5 龙眼多糖和燕麦多糖的流变学特性

2.5.1 多糖质量分数对溶液黏度的影响 龙眼、燕麦多糖的流体曲线如图4，在0.1～1 000 s-1剪切速率范围内，随着剪切速率的增大，低质量分数的多糖溶液由剪切稀化的假塑性流体向牛顿流体转变，相同质量分数下，燕麦多糖溶液的表观黏度均大于龙眼多糖。当燕麦多糖质量分数为3%时，在剪切速率0.1～400 s-1范围内，溶液均呈现明显的非牛顿流体的剪切稀化现象。

2.5.2 温度对多糖溶液黏度的影响 温度影响分子的热运动，同时影响分子间的相互作用。温度对2 种多糖黏度影响结果如图5，在10～80 ℃范围内，随着温度升高，不同质量分数的多糖溶液黏度均逐渐下降，并趋于平稳。2 种多糖质量分数越大，则黏度随温度变化越明显。3%燕麦多糖溶液，随着温度升高溶液黏度明显降低。

图4 浓度对龙眼多糖和燕麦多糖流体性能的影响Fig.4 Effects of mass fraction of longan polysaccharides and oat polysaccharides on flow curve

图5 温度对龙眼多糖、燕麦多糖溶液流体性能的影响Fig.5 Effects of temperature on flow curve of longan polysaccharides and oat polysaccharides

3 讨论

肠道是人体的消化吸收场所，肠道菌群在宿主内参与人体内营养和活性成分的代谢、转化和吸收，影响着人体的健康和疾病的发展。干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌亚种、粪肠球菌是人体肠道内的益生菌，有促进人体消化吸收、阻止致病菌的定殖和入侵等作用。葡萄糖是糖酵解起始物，能够被直接利用，但也能被非益生菌利用。菊粉作为典型多糖益生元代表，被益生菌利用扩大肠道内益生菌定殖数量形成生物屏障调节肠道，而非益生菌无法利用。本研究发现龙眼多糖作为唯一碳源对干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌增殖作用明显优于菊粉，对植物乳杆菌亚种、粪肠球菌的增殖作用与菊粉益生元作用相似。燕麦多糖对干酪乳杆菌无明促进增殖作用，对嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌亚种、粪肠球菌的增殖作用优于空白对照组。这一结果与Jaskari 等[21]研究发现燕麦β-葡聚对嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌的增殖效果相符合。此外益生菌消耗碳源增殖并代谢产酸导致培养基溶液的pH 值下降，当4 种菌以龙眼多糖为发酵底物时，48 h 时培养基的pH 值已显著降低，这有利于抑制大肠杆菌的增殖[22]。而4 种益生菌以燕麦多糖为发酵底物时，培养72 h 培养基的pH 值无明显变化。

多糖因其单糖组成、糖苷键种类、聚合度的不同，导致其溶解性、流变学特性及生理功能不同。分析表明龙眼多糖和燕麦多糖差异主要涉及单糖组成、相对分子质量分布及流变学特性。2 种多糖总糖含量均高于60%。并且脱蛋白后2 种多糖的蛋白含量均较低；在龙眼多糖中糖醛酸含量为10.1%，其结果略高于Yang 等[10]、王雪艳等[23]的测定结果；燕麦多糖中糖醛酸含量为5.9%，低于龙眼多糖。龙眼多糖中还原糖含量为16.0%，说明在龙眼多糖中有一定比例的游离醛基或酮基的糖类存在。从GC/MS 面积归一化法测定结果来看，龙眼多糖中葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖占总相对含量的90%以上，与先前研究结果相一致[24]；燕麦多糖中葡萄糖和少量甘露糖占总相对含量的91%。本研究采用凝胶色谱法测定的龙眼多糖分子质量为6.38×106u，且分子质量分布较宽；蓝海波[25]经排阻层析得到5 种龙眼多糖分子，分子质量在3.58×104～8.38×107u 之间，因此推测龙眼多糖可能是由多种不同分子质量的杂多糖组成。燕麦多糖分子质量分别为5.42×102，2.45×106u，其中分子质量为2.45×106u 的多糖部分在Wood[26]和Bhatty[27]报道的燕麦β-葡聚糖分子质量范围内（4.4×104u～3.0×106u），此外结合GC/MS 结果也表明葡萄糖在燕麦多糖占比高，β-葡聚糖是以D-葡萄糖为单糖通过β-（1→4）和β-（1→3）糖苷键链接而成，因此推测分子质量为2.45×106u 的多糖部分很可能为燕麦β-葡聚糖。通过扫描电镜观察，在放大200 倍下，2 种多糖均无固定形态，符合多糖的结构特性；放大500 倍，龙眼多糖表面光滑，说明物质排列紧密；燕麦多糖表面粗糙，网孔分布呈结构类似海绵；放大5 000 倍，龙眼多糖呈现孔状结构；燕麦多糖呈现有空隙结构的不规则颗粒，排列松散，表面变粗糙。采用流变仪分别测定2 种多糖的表观黏度，发现2 种多糖溶液的表观黏度随质量分数升高而增大，说明2 种溶液黏度具有明显的质量分数依赖性；在相同质量分数下，燕麦多糖溶液的表观黏度高于龙眼多糖溶液；此外，2 种多糖溶液的，黏度均随温度的增加而下降，可能是温度升高所导致的聚糖分子链柔顺程度增强使流动性提高[20]，且燕麦多糖溶液的黏度对温度变化更敏感。

龙眼多糖主要以1→6 键，1→4 键连接的多种单糖组成，其中的多糖组分复杂，主要是以较多分支的酸性吡喃多糖存在形式[28-29]。燕麦多糖主要由燕麦β-葡聚糖构成，它是由β-D-吡喃葡萄糖通过β-（1→3）糖苷键和β-（1→4）糖苷键连接而成的无分支黏多糖[30]。多糖结构复杂，益生菌需要产生糖苷酶来利用碳源，因此葡萄糖为碳源时益生菌快速增殖并且耗净碳源不利于活菌数维持较长时间，而多糖为碳源时消耗较慢，维持益生菌活菌数稳定[31]。此外，多糖分子质量的大小影响物质的溶解性和黏度，与多糖跨越细胞膜障碍相关。2种多糖重均分子质量相差不大，但龙眼多糖溶解性优于燕麦多糖，良好的溶解性是发挥生物活性的首要条件，当燕麦多糖质量分数大于3%时，黏度明显增大。有研究表明，燕麦β-葡聚糖在体内作益生效果随分子质量增大而减小，随剂量提高而增大，黏度过高也不利于多糖的扩散及吸收[32]。

4 结论

龙眼多糖对干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌及粪肠球菌的增殖作用明显，燕麦多糖对以上4 种益生菌的增殖作用存在差异，通过测定2种多糖的理化性质，比较后发现2 种多糖的差异主要为单糖组成、分子质量分布和黏度。虽然燕麦多糖的体外益生效果不如龙眼多糖，但燕麦多糖中β-葡聚糖在低质量分数时就具有较高的黏度，在体内能刺激肠促胰肽酶释放增加小肠蠕动调节肠道环境[22]，若将两者混合搭配加入食品中很可能会产生协同调节肠道的作用。