米酒液态发酵过程中理化指标和风味物质变化规律

张洋洋，张伟国 ，徐建中，钱 和，马雄承，朱幸炜

（1. 江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；3. 上海大陆酿造有限公司，上海 202150）

米酒是中国传统酿造酒之一，以糯米为主要原料经液化、糖化、发酵而成[1]，因其风味独特、醇香诱人，具有养胃、活血通脉、防病御寒等保健功能，深受广大消费者喜爱[2]。米酒多为传统固态发酵[3]，该方法生产效率低，产品品质难以控制；而液态发酵因其适用广泛、节能、品质易控等优点，应用广泛[4]。但液态发酵生产米酒存在酒体和风味寡淡等问题[5]。目前国内外对液态发酵生产米酒研究多集中在工艺部分，刘幼强等通过分析原料米品种选择、不同程度加工和打磨精度，粉碎后制备米粉，研究米酒酿造新工艺[6]；邹凌波建立酶法酿造米酒新工艺[7]，但对米酒液态发酵过程中风味物质变化规律研究较少。

试验在前期优化米酒液态发酵工艺基础上，采用GC-TOFMS 和游离氨基酸专用高效液相色谱动态分析米酒液态发酵不同阶段挥发性风味物质、游离氨基酸，并测定基本理化指标和感官品评，获得米酒发酵过程中风味物质变化规律。本研究对精确控制液态发酵生产米酒以及提高米酒质量具有重大意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糯米（市售）；安琪高活性酿酒酵母、安琪白酒曲（安琪酵母股份有限公司）；耐高温a-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶（诺维信（中国）生物技术有限公司）；样品取自不同发酵阶段：A-主发酵中期，发酵时间4.5 d，发酵温度27 ℃；B-主发酵期结束，发酵时间9 d，发酵温度27 ℃；C-后发酵中期，发酵时间2.5 d，发酵温度15 ℃；D-后发酵期结束，发酵时间5 d，发酵温度15 ℃；E-低温静置期，发酵时间2 d，发酵温度4 ℃。

1.2 仪器与设备

Pegasus BT气相-高通量飞行时间质谱仪（美国力可公司）；游离氨基酸分析专用高效液相色谱（美国安捷伦科技有限公司）；数显恒温水浴锅（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；PL2002型电子分析天平、PB602-N 型分析天平（瑞士Mettle-Toledo公司）；HYL-B 型全温摇瓶柜（太仓市强乐实验设备厂）。

1.3 方法

1.3.1 试验室条件下工艺流程

糯米原料→清洗、除杂→浸泡→打浆→液化→糖化→发酵→过滤→原酒。

1.3.2 基本理化指标测定

总酸、酒精度和氨基态氮含量测定：参照文献[8]方法；还原糖含量测定：采用2, 3, 5-三硝基水杨酸比色法[7]；酵母数目测定：参照文献[9]方法。

1.3.3 挥发性风味物质测定

顶空固相微萃取条件：取8.0 mL酒样至20 mL顶空进样瓶中，加入3.0 g NaCl，充分溶解后加入27.92 μg·L-1己酸甲酯作为内标。

GC-TOFMS 条件：色谱条件：DB-FFAP 色谱柱；高浓度载气He，流速1 mL·L-1；升温程序：起始温度40 ℃，保持3 min，以10 ℃·min-1速率升温至230 ℃，保持5 min；质谱条件：EI 离子源，离子源温度210 ℃，电子能量70 eV，传输线温度250 ℃；全扫描模式（SCAN），质量扫描范围35～400 aum。

挥发性风味物质定性与定量：定性采用样品质谱与NIST 2.0标准谱库比对鉴定；定量采用内标法，根据下面公式计算：

式中，Ci-样品中各挥发性化合物浓度（μg·L-1）；Cs-内标己酸甲酯浓度（μg·L-1）；Ai-样品中待测物质对应色谱峰面积；As-内标色谱峰面积。

1.3.4 游离氨基酸含量测定

用装备有安捷伦ZORBAX SB Aq 柱（250 mm×4.6 mm）游离氨基酸分析专用高效液相色谱检测米酒中游离氨基酸组成。

色谱条件：柱温25 ℃；流动相A，甲醇；流动相B，50 mmol · L-1醋酸钠缓冲液（pH 6.5）； 梯度洗脱程序：A：25%，B：75%，0～3 min；A：35%，B：65%，8 min；A：45%，B：55%，23～25 min； A：25%，B：75%，30 min。

1.3.5 感官分析

感官培训参考文献[5, 10]方法，选择10名（5男5 女）至少经半年米酒感官评价训练研究生作为品评员，所有感官训练均在20 ℃感官品评室中完成。10 名品评员通过观察、嗅闻和品尝米酒，确定米酒描述性特征，包括外观、香气（酒香、米香）、风味（酸、甜、苦、辣）、口感（涩、酒体丰满）、风格。品评人员对每个特征评分范围为0～10（0：无；1～3：非常弱；4～5：普通；6～7：中等；8～9：强；10：非常强）。

1.3.6 数据处理与分析

利用Excel 2016、Origin 2018、R 语言（ggplot2、pheatmap、ggradar 包）、Adobe Illustrator CC2018、SPSS 25.0等软件处理数据及绘制图表。

2 结果与分析

2.1 基本理化指标

不同发酵阶段总酸、还原糖、氨基酸态氮、酒精度、酵母数目如表1所示。总酸是酒类产品重要指标，对酵母生长、成品酒酒体和风味贡献较大[11-12]，A-D 阶段总酸逐渐升高，因酵母代谢旺盛，在一系列酶作用下将代谢生成的部分丙酮酸转化为酸类等物质以及产酸菌大量繁殖，但在DE阶段总酸下降，因为在低发酵温度下，部分产酸菌受抑制以及缓慢酯化反应，与Li 等研究结果一致[12]。

表1 不同发酵阶段基本理化指标Table 1 Physicochemical indices of different fermentation stages

由于蛋白酶分解以及酵母自溶使氨基酸态氮升高，酵母不断利用糖发酵使酒精度逐渐升高，因此，还原糖含量逐渐下降，氨基酸态氮和酒精度逐渐上升。酵母数目在A-B 阶段升高，在B 阶段达最大，进入C阶段后数目开始减少，由于A-B阶段酵母快速繁殖满足发酵需要，随温度条件改变酵母进入C-E 阶段，酵母活性减弱及自溶，数目减少。

2.2 不同发酵阶段挥发性组分变化

2.2.1 不同发酵阶段共有组分分析

米酒发酵过程中全部风味物质含量见表2，为进一步研究和表征发酵过程中挥发性组分变化，选取不同发酵阶段共有组分作热图分析。由图1可知，不同发酵阶段共有挥发性物质72 种，其中酯类27种、醇类19种、酸类9种、醛类8种、酚类2种、呋喃1种，其他6种。

表2 不同发酵阶段挥发性物质Table 2 Volatile substances in different fermentation stages

续表2

续表2

本研究检测到27 种酯类物质，包括20 种乙酯类和4种乙酸酯类，在发酵过程中，含量较高的酯类为乙酸异戊酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、棕榈酸乙酯（见表2）。乙酸异戊酯、己酸乙酯、乳酸乙酯在A阶段含量较高，B-D阶段呈下降趋势。由于发酵条件改变影响酯水解酶活力，促使酯水解成相应醇和酸，与过表达IAH1编码的酯降解酶导致酯浓度显著下降一致[13]。辛酸乙酯有白兰地酒香味，在A阶段含量较高，随发酵呈下降趋势，而乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、棕榈酸乙酯等则呈波动变化，丁二酸二乙酯在发酵过程中一直呈上升趋势。

由图1 可知，除辛醇、2-辛醇、1-辛烯-3-醇外，几乎所有醇类物质在A阶段含量较高，在B-E阶段呈波动变化。其中，苯乙醇、异丁醇、异戊醇、2,3-丁二醇是米酒中主要醇类。适量苯乙醇、异丁醇、异戊醇可增加酒协调性，主要通过氨基酸降解途径（Ehrilich途径）和糖合成代谢途径（Harris 机制）[14]生成。A-C 阶段其含量快速下降，D-E阶段则缓慢上升，原因一方面为醇类物质与酸发生酯化反应，生成相应酯；另一方面，氨基酸通过Ehrilich 途径生成相应高级醇，如苯丙氨酸降解生成苯乙醇、缬氨酸降解生成异丁醇、亮氨酸降解生成异戊醇。2,3-丁二醇是酒类中极少数呈香多元醇之一，呈黄油和奶油香气[15]，主要在A 阶段生成，与陈青柳等对黄酒发酵过程中醇类物质变化研究一致[16]。另外，米酒中检测到1-辛烯-3-醇，但含量较少，呈波动变化，同时清酒[17]、石榴汁[18]、黄酒[19]中均有检测。

米酒中检测到9种酸类，乙酸、异丁酸、辛酸是主要酸类（见表2）。乙酸又称醋酸，在发酵初期含量较高，含量呈先降后升趋势。异丁酸有轻微酸气味和奶酪香，发酵过程中呈上升趋势，赋予酒体协调的口感。如图1所示，在发酵过程中辛酸含量A阶段较高，B-D阶段呈波动下降趋势，E阶段有所上升。

醛类、酚类、呋喃类、酮类、醚类以及萜类，不同阶段含量变化较为明显，如缩醛中1,1-二乙氧基戊烷在不同阶段波动较为明显，由于缩醛类化合物来源于醇和醛可逆缩合反应[20]，发酵条件改变发酵体系中酸性环境，其又水解成相应醛和醇。2,4-二特丁基苯酚、2,3-二氢苯并呋喃、2-庚酮、乙烯基乙醚在A-D阶段呈逐渐下降趋势，E阶段上升，最终含量趋于稳定。

2.2.2 不同发酵阶段挥发性物质种类动态变化

由图2 可知，不同发酵阶段醇类、酯类、酸类、醛酮类、酚类、呋喃类等种类数量动态变化，醇和酯种类先增后趋于稳定，而酸、呋喃以及其他物质在发酵过程中变化小，在一定程度上表明酒体趋于稳定。米酒醇酯比是评估风味特征重要指标，3～4 适宜，超过5之后，醇类物质起主导作用。由图2 可知，A-B 阶段醇酯比较为适宜，C-D阶段升高，醇类开始占主导作用，但E阶段反而下降，达到6 左右，与Yang 等对黄酒研究相似[5]，说明黄酒研究在一定程度上可为米酒研究提供参考，同时醇酯比在E阶段下降，说明低温静置可能有利于酯形成，为进一步提高米酒品质提供思路，即适当减少后发酵时间增加低温静置时间。

2.3 游离氨基酸动态分析

米酒中氨基酸含量丰富，主要来源于原料中蛋白质酶解及酵母自溶，常见17 种氨基酸又可分为鲜味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸和涩味氨基酸[21]，在发酵过程中一部分氨基酸被酵母利用，一部分转变为高级醇，其余则作为米酒一部分。

图3是发酵过程中各阶段氨基酸富集图，从图3 中可清晰看出， Leu、 Glu、 Arg、 Pro、 Ala、Phe、Vla 是米酒中主要氨基酸，17 种氨基酸含量随发酵呈上升趋势，苦味氨基酸Leu、鲜味氨基酸Glu、甜味氨基酸Pro 含量分别达（369.99±3.24）、（325.14±9.62）、（266.59±5.04） mg·L-1。

图4显示米酒发酵过程中不同类别氨基酸总量及总氨基酸动态变化，苦味氨基酸是其主要氨基酸。发酵过程中，总氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸、鲜味氨基酸、涩味氨基酸呈上升趋势，原因可能是原料酶解与酵母自溶。在对中国浊酒研究中发现，随发酵时间增加，总氨基酸含量、甜味氨基酸、苦味氨基酸、鲜味氨基酸、涩味氨基酸也逐渐增加[21]，但发酵结束时，浊酒各氨基酸含量均低于米酒[38]，说明米酒口感更丰富饱满。

2.4 动态感官分析

由图5可知，在发酵初期A阶段，甜味、米香突出，但风格欠缺，酸甜苦涩等味觉指标较强。B-E阶段酒香增强而米香减弱，风格逐渐形成，酒体趋于丰满，酸、甜、苦、涩等味觉指标减弱，不同发酵阶段层次分明，辛辣感虽逐渐增强，但区别不明显，酒中辛辣多由醛类物质产生，与图1醛类物质变化一致。

3 讨论与结论

米酒风味源于酯、醇、酸等物质相互作用[22]。酯类由米酒中酵母代谢产生的醇与酸发生酯化反应而生成，形成水果味和花香[23]，是米酒中重要风味物质之一。本研究中乙酯类如己酸乙酯、乳酸乙酯在发酵过程中呈下降趋势，可能与发酵体系中相应菌特定酶活有关，因此可通过检测相应菌酶活，改善米酒质量。辛酸乙酯和丁二酸二乙酯变化趋势分别与李红蕾等[24]对黄酒研究和陈青柳等[16]对绍兴机械黄酒发酵一致，说明米酒与黄酒存在一定相似性，因此黄酒部分规律可为米酒液态发酵研究提供参考。

醇类也是米酒中主要风味物质之一，赋予米酒醇香[25]。唐柯等研究石榴酒发酵过程中香气动态变化规律发现，苯乙醇、异戊醇、异丁醇呈先降后升趋势[18]，与本研究结果一致。酸类作为米酒中重要呈味物质，其含量直接影响米酒口感，如低含量辛酸可赋予酒水果香和花香，但含量较高则产生腐败味和涩味[11]，本研究中辛酸含量后期增加，可能对米酒风味产生不利影响。

米酒中风味物质种类也影响米酒质量，苏佳佳等分析发酵各阶段糙米酒酿风味变化发现，醇、酯、醛、酸类等风味化合物随糙米酒酿发酵时间增加种类先增后趋于稳定[26]，但本研究中醛酮类种类前期呈上升趋势，后期下降，可能是后期低温环境有利于减少醛酮类物质产生。与醇酯比研究结果相似，可通过延长后期低温发酵时间改善米酒质量。

米酒中氨基酸一方面丰富酒体颜色，另一方面作为营养物质为酵母生长提供氮源且是风味前体物质，为米酒提供丰富口感[21]。Wang 等研究绍兴地区黄酒风味变化发现，Ala、Arg、Asp、Glu、Gly、Leu、Pro 是绍兴黄酒中主要氨基酸[27]，与本研究不同，体现不同工艺下风味特色。感官分析是对米酒产品质量最直观评价，本研究结果表明，米酒生产中可根据不同发酵阶段感官品评及时调控生产。