荷斯坦奶牛FGFR2基因组织表达及生物信息学分析

邓惜缘，刘丽元，周子航，温 万，高旭红，顾亚玲

（1. 宁夏大学农学院，银川 750021；2.宁夏畜牧站，银川 750004）

荷斯坦奶牛原产于荷兰，为一种风土驯化能力极强的品种，适应性强、体型大、产奶量高，是我国存栏量最多品种，全年平均产乳量超7 000 kg。我国荷斯坦奶牛又分为乳用型荷斯坦奶牛和兼用型荷斯坦奶牛。

成纤维细胞生长因子受体家族（Fibroblast growth factor receptor，FGFR）包括5 个基因，其中FGFR1、FGFR2、FGFR3 和FGFR4，为跨膜酪氨酸激酶受体，其胞外区具有2 或3 个免疫球蛋白（Ig）样结构域，而FGFR5 缺乏细胞内蛋白酪氨酸激酶结构域，该结构域被一个短的富含组氨酸基序的胞内尾部取代[1]。FGFR2 全称为成纤维细胞生长因子受体2，位于奶牛第26 号染色体，全长107 412 bp，具有不同亚型，在上皮细胞中编码FGFR2b 亚型，在间质细胞中编码FGFR2c 亚型。FGFR2 基因分别结合不同FGF 激活信号通路，介导FGFs 信号传递入细胞质，为b FGF 最主要受体。b FGF与其结合后可激活细胞内丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）和磷脂酰肌醇-3 激酶和蛋白激酶B（PI3K/AKT）等信号通路调节血管内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞和神经胶质细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层的细胞分化增殖，还参与机体多种生理病理学过程（如胚胎发育、组织愈合、肿瘤发生与转移）[2]。Cunningham 等最新研究扩展FGF 信号已知领域，并为功能研究确定许多新靶点[3]。FGF信号通路结构灵活，在典型的RAF/MAPK/ERK/RSK和PI3K/AKT/PDK/mTOR/S6K 通 路 中，FGFR2 激 酶活性抑制反应被识别。同时观察到磷酸化依赖性负反馈途径被抑制，定义FGFR2 抑制的内在抗性机制。该发现对FGFR 抑制剂治疗应用有指导意义，因FGFR抑制剂识别具有相同遗传损伤和耐药途径细胞的反应。

本课题组以宁夏地区1 280头荷斯坦母牛为研究对象，利用Illumina 牛150K Bovine 全基因组SNP 芯片作基因分型，对5 个泌乳性状（产奶量、乳脂率、乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量）与体细胞评分，运用Farm CPU 统计方法作全基因组关联分析[4]。在奶牛第26号染色体上存在P值4.68×10-8且名为ARS-BFGL-NGS-106897 的SNP 位点与奶牛体细胞数有关，与其相距30 kb即41 956 121 bp存在FGFR2基因且最小等位基因频率为0.55。通过GO分析发现，FGFR2 参与FGF 信号通路（P00021），也参与多种生物学过程，如MAPK 级联、细胞分化、细胞增殖和凋亡过程负调控。因此本研究分析前期GWAS 筛选出的FGFR2 基因不同组织表达量，再分析荷斯坦奶牛FGFR2 基因生物信息学，以期为进一步研究荷斯坦奶牛FGFR2 基因生物学功能提供参考，为后期FGFR2 基因功能验证提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品

荷斯坦奶牛来自宁夏回族自治银川市贺兰县茂盛奶牛场，选择3头具有相同父本且饲养管理条件相同的荷斯坦奶牛，取屠宰后奶牛组织（肝脏、卵巢、乳腺、肾脏、心脏、子宫），DEPC 水洗净，液氮速冻后送回实验室，-80 ℃保存，备用。

1.1.2 主要试剂与仪器

主要试剂：LA Taq（DRR02AG）(TaKaRa)，反转录试剂盒（TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit）（艾德来）；2×SYBR®Green 预混液（中国DF）；pcDNA3.1-EGFP-C 载体（优宝生物）；DH5α感受态细胞（天根）。

主要试验仪器：analytikjena-qTOWER 2.2型荧光定量PCR 仪（德国）、SCILOGEX D3024R 离心机（美国）、普通PCR 仪analytikjena-Easycycler（德国）、超微量核酸蛋白测定仪scandrop100（德国）、移液器（美国bio-rad）、U-3010 紫外-可见分光光度计（Hitachi）、凝胶成像系统（Gene Genius）、H6-1微型电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂）、SW-CJ-1D 洁净工作台（上海琪特分析仪器有限公司）、DYY-8 型稳压稳流电泳（江苏苏洁净化设备厂）、PCR 反应仪扩增仪（加拿大BBI）、YXJ-2 离心机（湘仪离心机仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及反转录

使用Trizol 提取荷斯坦奶牛不同组织总RNA，通过凝胶电泳试验检测提取效果，超微量核酸蛋白测定仪（scandrop100）检测RNA其OD260/OD280值。

采用Aidlab 公司反转录试剂盒（TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit）反转录，采用20 μL 反应体系：总RNA 500 ng、5×RT Reaction Mix 4 μL、Rondam primer/oligodT 0.8 μL、 TUREscript HRTase/RI Mix 0.8 μL、RNase Free dH2O 加至20 μL。反转录反应条件如下：42 ℃40 min，65 ℃10 min反应结束后，得到cDNA，-80 ℃保存。

1.2.2 奶牛FGFR2基因克隆

根据GenBank 中已知牛FGFR2 基因序列（XM_024985484.1）及GADPH 序列（NM_0010 34034.2），利用Primer Premier 5.0 设计特异性荧光定量引物，由陕西致研生物科技有限公司合成。

由于CDS 区序列较长，分六段扩增，由上海生工生物工程股份有限公司合成。具体引物序列如表1所示。

PCR 扩增体系（25 μL）：2X GC Buffer I 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）0.2 μL，ddH2O 10.1 μL，Template 1 μL（cDNA）、Taq 酶(5 U·μL-1) 0.2 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，72 ℃修复延伸7 min，循环33次。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，特异性好扩增产物保存于-20 ℃冰箱备用。纯化后产物通过TA 克隆将该序列在16 ℃连接至pcDNA3.1-EGFP-C 载体，转化到大肠杆菌DH5α 感受态细胞，涂板于LB 固体培养基，37 ℃培养12 h，蓝白斑筛选，选择白色菌落菌液送至上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.3 组织表达差异分析

根据序列设计实时荧光定量PCR 引物, 检测FGFR2 基因在心脏、肝脏、乳腺、子宫、卵巢和肾脏组织表达量。反应体系（10 μL）：2×SYBR®Green Supermix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。反应程序：95 ℃PCR 预变性3 min，95 ℃变性10 s，58 ℃组合延伸30 s，循环39 次。共设置3 个生物学重复以及3 个技术学重复，以GAPDH为内参，利用2-△△Ct计算各样品基因相对表达量，利用SPASS 22.0 分析荷斯坦奶牛FGFR2基因不同组织表达量单因素差异。

1.2.4 生物信息学分析

基 本BLAST 检 索（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）；利用Prot-Param 在线软件分析理化性质（http：//web. expasy.org/protparam /）；利用DNAMAN比对序列；运用SignalP 4.1 软件分析信号肽（http：//www.ebs.dtu.dk/services/SignalP/）；运用ProtScale 软件分析亲疏水性（http：//web.expasy.org /protscale/）；通过在线软件TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测蛋白质跨膜结构；保守结构域通过NCBI 上CDD 预测（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）；运用Psort 软件分析亚细胞定位（https：//www.genscript.com/psort.html）；通过在线软件Prabi 服务器SOPMA 程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/）预测蛋白质二级结构，通过在线软件SWISS-MODEL（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl）预测蛋白质三级结构，研究确定FGFR2 蛋白质各项生物信息，了解该基因部分功能。

2 结果与分析

2.1 FGFR2基因RNA提取与扩增及克隆测序

不同组织RNA 提取后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳效果见图1，产物用超微量核酸蛋白测定仪（scandrop100）检测RNA OD 值（见表2），可看到明显的28S与18S条带，全部符合RNA要求。以荷斯坦奶牛乳腺组织为模板，分六段扩增，引物特异性较好，六段目的基因片段长度符合要求，结果见图2。

2.2 荷斯坦奶牛FGFR2基因组织表达分析

目的基因FGFR2扩增曲线图3，图4为溶解曲线，产物TM 值为80 ℃。内参基因GAPDH 为扩增曲线图5，图6 为溶解曲线，产物TM 值为83 ℃。综合溶解曲线与扩增曲线图，试验结果可靠。

表2 不同组织RNA提取浓度与纯度检验Table 2 Test of RNA extraction concentration and purity in different tissues

以GAPDH为内参，利用2-△△Ct计算各样品基因相对表达量，利用SPSS 25.0 一般线性模型（GLM）作平均值下单因素方差分析，Duncan's多重检验结果显示，乳腺组织FGFR2 基因mRNA 表达量最高，并极显著高于肝脏、卵巢、子宫和心脏，与肾脏组织mRNA表达量差异不显著（见图7）。

2.3 荷斯坦奶牛FGFR2蛋白理化性质分析

ProtParam 在线服务器分析结果如图8 和表3所示，奶牛FGFR2 基因编码790 个氨基酸，20 种氨基酸中亮氨酸（Leu）数目最多，共64 个，占全部氨基酸8.1%。负电荷残基（Asp+Glu）总数为100，正电荷残基（Arg + Lys）总数为89，分子式为C3923H6159N1067O1190S44，相对分子质量为12 383。半衰期为30 h，脂肪指数为78.71，亲水性平均值为-0.409。基因编码产物不稳定指数为46.09，显示编码产物不稳定。

表3 荷斯坦奶牛FGFR2蛋白氨基酸组成Table 3 Amino acid composition of FGFR2 protein in Holstein cows

2.4 荷斯坦奶牛FGFR2基因序列相似性及系统进化树分析

利用Meg Align 软件将克隆得到的荷斯坦奶牛FGFR2 基因序列与家猫、黄牛、家鸡、猕猴、黑猩猩、野猪、家犬、绵羊、热带爪蟾、苏门答腊猩猩基因序列作相似性比对，其中荷斯坦奶牛与黄牛序列相似性高达100%，与热带爪蟾相似性最低为67.2%（见表4）。基于Tamura-Nei 模型最大似然法推导进化树模型，选择具有最高对数可行性的树（-6 150.52），将Neighbor-Join 和BioNJ算法应用于最大复合似然（MCL）方法估计成对距离矩阵，选择具有优越对数似然值拓扑，最后获得用于启发式搜索的初始树。分析涉及10 个核苷酸序列，所有包含空白和缺失数据的位置均删除，所有进化分析在MEGA7.0 中完成，结果显示荷斯坦奶牛与黄牛亲缘性最近，其次为野猪；而与热带爪蟾较低等脊椎动物相距最远（见图9）。

2.5 荷斯坦奶牛FGFR2蛋白疏水性分析

运用ExPASy 服务器中ProtScale 程序分析奶牛FGFR2 蛋白亲疏水性发现，第358 位丙氨酸（Ala）疏水性最强为3.211，第167 位赖氨酸（Lys）疏水性最弱为-2.622，在负值区域有较多氨基酸（见图10）。

表4 荷斯坦奶牛与其他10 个物种FGFR2基因序列相似性比对Table 4 Sequence similarity comparison of FGFR2 gene between Holstein cows and other 10 species

2.6 荷斯坦奶牛FGFR2蛋白跨膜结构预测及信号肽分析

运用TMHMM 2.0 分析奶牛FGFR2 基因蛋白跨膜结构，预测结果如图11 所示。结果表明，FGFR2 蛋白存在1 个跨膜结构，位于第344～366 氨基酸残基之间。使用SignaIP 4.1在线软件预测蛋白信号肽发现，编码产物C 值为0.112，Y 值为0.107，S 值为0.116，荷斯坦奶牛FGFR2 蛋白不具有信号肽（见图12）。结合软件SecretomeP2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/）分 析， 得 到SecP score分数高于0.6，则荷斯坦奶牛FGFR2基因编码蛋白属于非经典分泌蛋白。

2.7 荷斯坦奶牛FGFR2蛋白二级结构和三级结构预测

由图13 可知，α-螺旋占23.80%，β-转角占4.18%，无规则卷曲占51.27%， 延伸链占20.76%。由此推测，无规卷曲为荷斯坦奶牛FGFR2 最大量二级结构元件，α-螺旋、β-转角和延伸链散布其中。由图14可知，FGFR2蛋白以无规卷曲和α-螺旋为主，与二级结构分析一致。

2.8 荷斯坦奶牛FGFR2蛋白亚细胞定位分析

运用PSORTⅡ预测FGFR2 编码产物亚细胞分布情况：细胞质21.7%，细胞核43.5%，线粒体17.4%，质膜4.3%，液泡4.3%，过氧化物酶体4.3%，分泌系统小泡4.3%。

2.9 荷斯坦奶牛FGFR2蛋白保守结构域预测

运用NCBI 的CDD 数据库预测荷斯坦奶牛FGFR2 蛋白保守结构域。如图15 所示，荷斯坦奶牛FGFR2蛋白有3个特定匹配和2个匹配的超家族保守结构域。

3 讨 论

FGFR2 基因已确定与胃癌[5-6]、乳腺癌[7-8]、和胆管癌[9]等多种癌症密切相关，且Pemazyre 治疗FGFR2 基因融合型胆管癌已获得美国FDA 首批认证[10-12]。在骨骼发育过程中, FGFR2 基因可调节位于软骨膜、骨膜和颅缝处前骨生成细胞和骨生成细胞增生和分化[13]。Brajadenta 等研究发现FGFR2基因中至少有7 个突变引起Apert（尖头并指综合征）综合征[14]。Kim 等研究发现FGFR2 信号为导致面中部前后向空间异常关键因素，研究结果为预防FGFR2基因突变引起的颅面畸形提供新疗法[15]。为证明FGFR2 主要影响软骨细胞增生和分化，尹良军等应用基因敲入技术建立FGFR2 功能获得型基因突变小鼠模型，研究发现FGFR2 不仅具有调控成骨细胞系发育功能，还具有调控软骨细胞系发育重要功能，从而同时影响膜内成骨和软骨内成骨，在骨骼发育、骨折修复等方面发挥重要作用[16]。可知FGFR2在调节骨相关生长发育中发挥作用。

分析克隆的荷斯坦奶牛FGFR2 基因序列发现，该基因CDS 区序列长2 372 bp，编码790 个氨基酸，其中亮氨酸含量最多，亮氨酸增加蛋白质合成，抑制蛋白质分解。亮氨酸代谢产物α- 酮戊己酸（α-KIC）和β- 羟基-β- 甲基丁酸（HMB）具有调节蛋白质代谢作用。带负电荷残基总数（Asp+Glu）大于带正电荷残基总数（Arg+Lys），故FGFR2基因编码蛋白质带负电荷， 其不稳定指数为46.09，为不稳定蛋白，预测该蛋白为亲水性蛋白。由于具有跨膜结构但无信号肽，则推测为非经典分泌蛋白，与FGF2分泌途径：由质膜直接易位介导，依赖于质膜内磷脂酰肌醇（4,5）二磷酸和质膜外层的硫酸乙酰肝素蛋白多糖结论一致[17-18]。

毕艳楠等研究发现奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌诱导小鼠乳腺组织中FGFR2 表达量显著升高[19]，表明FGFR2 基因与奶牛乳腺纤维化分子作用机制关系密切，与前期GWAS 筛选结果一致，且与不同组织表达差异分析得出乳腺组织表达量最高结果也一致。王泽鑫等通过瞬时转染pcDNA3.1-TOPO-FGFR2 真核表达质粒进入人胆管癌Hucct1 和HEK293T 细胞，在细胞水平验证FGFR2基因过表达具有促进细胞生长作用，与GWAS 结论相符[20]。同时，毕艳楠等发现，FGFR2与bFGF共同作用促进奶牛乳腺成纤维细胞中PI3K 和Akt mRNA和蛋白表达[21]。

基于前期GWAS 及不同组织差异分析得出乳腺组织相对表达量高的结果，再结合其他学者研究可推断荷斯坦奶牛FGFR2 基因具有促进乳腺细胞生长作用，后期将开展细胞水平功能验证。

4 结 论

本研究成功克隆荷斯坦奶牛FGFR2基因, 得到2 373 bp 的CDS 区序列，编码790 个氨基酸残基；生物信息学分析结果显示，FGFR2 蛋白为非经典分泌蛋白，编码产物主要分布在细胞核；实时荧光定量PCR 结果显示，荷斯坦奶牛FGFR2 基因在乳腺组织中相对表达量最高。研究结果为荷斯坦奶牛FGFR2 基因在奶牛产奶性状相关调控机制研究提供理论依据。