全自动病理组织脱水机乙醇浓度的变化对组织块的影响及应对措施

夏伟

常州市妇幼保健院病理科 （江苏常州 213000）

全自动病理组织脱水机以处理标本量多、稳定好及安全性高等优点，一直以来得到了各医院病理科和科研机构的认可[1]。一张优质的病理切片的产生需经过诸多环节的质量控制，病理组织脱水即为其中重要的环节[2]。组织块在脱水机中的处理效果直接影响切片和染色质量以及免疫组化、原位杂交、二代测序等检测结果[1，3-4]。乙醇是病理实验室最常用的脱水剂，浓度过高或过低均会对组织处理产生不利影响，只有对乙醇浓度实施日常监测，并采取相应的措施，才可保证组织块在每一个换液周期内的脱水质量，同时发挥试剂的最大效能，减少废液排放，减轻维护保养人员的工作负担[5]。基于此，本研究探讨全自动病理组织脱水机乙醇浓度的变化对组织块的影响及应对措施，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

仪器设备：全自动封闭式病理组织脱水机（樱花精机 株 式 会 社，SAKURA Tissue-Tek-VP1型 ）；40%～50%、50%～60%、60%～70%、70%～80%、80%～90%、90%～100%的乙醇浓度计（精度为0.1%，河北省衡水创纪仪器仪表有限公司）；1 500 ml 量筒。

标本：收集2019年3月至2020年3月常州市妇幼保健院的所有手术标本、活检及内镜标本。

试剂：10%中性缓冲甲醛溶液（广州维格斯生物科技有限公司）；分析纯无水乙醇、二甲苯（江苏永丰化学试剂有限公司）；高效切片石蜡（熔点为58～60 ℃，上海华灵康复器械厂）。

1.2 方法

工作原理：樱花全自动病理组织脱水机共16缸，第1～2缸为10%中性缓冲甲醛溶液，第3～8缸为不同浓度梯度的乙醇，依次从低浓度乙醇到纯无水乙醇，第9～10缸为二甲苯，第11～14缸为液体石蜡，第15～16缸为清洗液，其中，第1～14缸容量均为3.50～3.75 L，第15～16缸容量均为5.00 L。

脱水处理时间及试剂更换如下。（1）脱水处理时间：第1缸10%中性缓冲甲醛溶液的处理时间为90 min，温度设置为35 ℃；第2缸10%中性缓冲甲醛溶液的处理时间为120 min；第1、2、3～6缸乙醇的处理时间分别为90、70、60 min；两缸二甲苯的处理时间分别为40 min 及35 min；四缸液体石蜡的处理时间分别为30、45、45及60 min；所有缸加压/减压（P/V）均打开。（2）试剂更换：将第1～2缸10%中性缓冲甲醛溶液倒掉，并更换新液体；将第1缸乙醇倒掉，清洗干净并晾干，倒入无水乙醇放在第8缸，所有乙醇的缸前移一缸；将第9缸二甲苯倒掉，第10缸前移，并将第9缸更换新的二甲苯放在第10缸的位置；将第11缸的石蜡倒掉，依次前移后面3缸石蜡，第11缸倒入新的石蜡后放在第14缸的位置。

1.3 观察指标

所有乙醇试剂的浓度均在20 ℃条件下进行检测，先检测每缸乙醇的基础浓度，随后每处理一批组织后，使用乙醇浓度计检测每缸乙醇的浓度并记录；分析所有组织块HE染色切片的质量。

2 结果

2.1 组织块脱水效果

在脱水机运行的第1～5次内，所有组织块均脱水良好；第6次偶有组织脱水不良，主要为淋巴结、乳腺组织，制片时易化开；第7次部分组织块脱水不良，主要为宫内膜及少量胎盘组织等，制片破碎，切完后的石蜡组织中央区内陷，其余小组织块均未见明显异常。

2.2 一个换液周期内乙醇浓度的变化

在一个换液周期内，第1缸乙醇浓度降低最快，第2缸乙醇浓度降低次之，第3～6缸乙醇浓度变化量依次减小，见表1。

表1 换液前后乙醇浓度变化（%，±s）

表1 换液前后乙醇浓度变化（%，±s）

项目 换液后 换液前 变化量第 1 缸 78.5±1.8 52.3±3.2 31.9±2.1第 2 缸 90.7±0.9 81.3±2.3 12.2±1.6第 3 缸 95.5±0.6 92.0±1.0 4.9±0.9第 4 缸 97.8±0.4 96.3±0.6 2.6±1.2第 5 缸 99.3±0.3 98.3±0.4 1.7±0.5第 6 缸 99.9±0.1 99.6±0.3 0.7±0.3

2.3 一个换液周期内组织块总数及脱水次数

一个换液周期内共处理（1 015±107）个组织块，组织脱水机运行（6±1）次。

2.4 组织块HE 染色质量

于显微镜下观察HE 切片，细胞核着色清晰、核浆对比明显、染色鲜艳，不影响病理诊断。

3 讨论

阶梯替换法与分组替换法是大多数实验室常用的换液方法，旨在使乙醇保持一定的浓度梯度，置换组织内的游离水，为透明、浸蜡提供条件，保证细胞形态、组织结构不被破坏，便于切片及后续检查等[6]。本研究通过对多个周期的乙醇浓度进行检测，得出乙醇浓度在一定范围内变化，可保证组织脱水质量稳定。

本研究通过检测多个周期内所有缸乙醇的浓度，发现第1、2缸乙醇的浓度变化幅度较大，联合分析第1～2缸的乙醇浓度数据，有利于判断脱水机的换液时机，监测组织块的脱水质量。本研究发现，当第1缸乙醇的浓度接近50%时，按照原来的脱水程序会出现部分大块组织脱水不良的现象，与文献报道结果类似[7]；当第1缸乙醇的浓度降低到50%附近时，第2缸乙醇的浓度接近80%，提示需对脱水机进行乙醇更换；当组织块数≤150个时，通过缩短低浓度乙醇的脱水时间，适当延长高浓度乙醇的脱水时间及二甲苯的透明时间，实验观察发现，组织脱水、透明、制片、染色均无显著差异；当组织块数＜150个且均以小组织块为主时，通过换液后处理发现，组织块明显质地较硬、脆，制片困难，个别组织的脱水效果不佳。经分析，其原因可能为浓度高的乙醇溶液脱水过快导致大组织块表面硬化，影响乙醇的渗透、置换，导致组织块内水分未能完全置换出来，组织透明、浸蜡不良[7-9]。本研究还发现，大组织块如宫内膜、乳腺、胃肠等组织，在临近换液时易发生脱水不彻底的现象，造成切片易化开，制片困难，切完片后组织蜡块凹陷，原因可能为组织块体积大、取材厚，当乙醇浓度过低时，通过充分置换后的组织内仍残留较多的低浓度乙醇，经过梯度乙醇脱水后，组织内的水分未能充分置换，二甲苯与水不互溶，导致组织透明、浸蜡不能完成，组织蜡块水分挥发最终出现蜡块中心组织凹陷，因此，当第1缸乙醇浓度降低到50%附近，且组织块数量＞150个，含有较多的含水脂肪等大组织块时，按照阶梯替换法进行换液后再作标本处理，组织块均处理良好，无明显异常；当尝试通过缩短低浓度乙醇的脱水时间，适当延长高浓度乙醇的脱水时间时，组织块脱水不良。当第1缸乙醇浓度接近50%，第2缸乙醇浓度≤80%时，换液后处理组织块，组织块脱水均未见明显异常，因此，当需更换试剂时，有必要参考最前面两缸的乙醇浓度，按照实验方法进行换液。

现将以上情形总结如下：（1）当第1缸乙醇浓度接近50%，第2缸乙醇浓度≤80%时，若组织块数量≤150个，则选择换液后处理或调整脱水程序后处理并且在下次脱水前换液；（2）当第1缸乙醇浓度接近50%，第2缸乙醇浓度＜80%时，若组织块数量＞150个，则选择换液后处理标本；（3）当第1缸乙醇浓度接近50%，第2缸乙醇浓度＞80%时，若组织块数量＜150个，则调整脱水程序后处理标本并且在下次脱水实验前测量第2缸乙醇的浓度，若第2缸乙醇的浓度仍＞80%，且标本量＜150个，则按（1）操作，若组织块数量＞150个，则选择换液后处理标本；（4）当第1缸乙醇浓度接近50%，第2缸乙醇浓度＞80%时，若组织标本量＞150个，则选择换液后处理标本。

综上所述，通过对乙醇浓度进行日常检测，发现了每缸乙醇浓度在每个换液周期内的变化规律，并及时调整程序、更换新液，保证了每批组织块的脱水质量；通过对乙醇浓度尤其是前两缸乙醇的浓度进行定期检测，有效把控了换液时机，保证了合理的乙醇浓度梯度。不同的实验室，其组织类型、数量不尽相同，脱水机种类、脱水程序也有所差异，建议各实验室在条件允许的情况下，通过参考本实验的方法选择恰当的换液方法及换液时机。