复方七芍降压片对TNF-α诱导的与平滑肌细胞共培养的血管内皮细胞中炎症因子与AP-1、MCP-1蛋白表达的影响

龚姗，李弘，刘叶倩，陈春茗，马丹凤，刘林，任卫琼∗

(1.湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410007；2.湖南省儿童医院，长沙 410006)

高血压是心血管疾病的独立危险因素之一，每年全球因高血压死亡人数约有900多万[1]，严重危害人类身体健康。血管重塑是许多血管疾病共同的关键病理环节[2]，也是高血压靶器官损害的病理基础和导致其他心血管疾病发生引起死亡的重要原因[3]。

高血压是一种慢性炎症性疾病，随着病程的发展，血管的切应力增加，更多的炎症因子会损伤内皮细胞，导致血管舒张功能降低，进一步促进血管内皮细胞的炎性损伤，引起平滑肌细胞的增殖、迁移，导致组织纤维化而出现血管结构的改变[4-5]。激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)是细胞内一类转录激活因子，能够诱导调控多种炎症因子的释放，加速内皮损伤，促进平滑肌细胞增殖和分泌，参与血管重塑[6-7]。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)是炎性反应重要的趋化因子，机体发生炎症时，导致血管内皮细胞受损，MCP-1大量分泌，促进血管内皮修复及血管新生[8]。因此，以内皮细胞炎症反应为切入点研究高血压病血管重塑的发生机制具有重要意义。针对高血压“虚、瘀、风”的病机，我们采用养阴柔肝、化瘀息风立法的复方七芍降压片治疗“肝肾阴虚、阴虚阳亢”型高血压。前期研究发现复方七芍降压片能降低患者血压[9]，有效降低原发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rat，SHR)肠系膜动脉上血管重塑标志物活性和炎症因子表达，改善血管重塑[10-11]，但是否与调控内皮细胞AP-1、MCP-1蛋白表达，影响内皮细胞炎症反应，调节平滑肌细胞增殖有关，尚不清楚。因此，本实验利用炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)诱导内皮细胞与平滑肌细胞共培养体系模拟高血压炎症环境，观察复方七芍降压片对内皮细胞炎症因子和AP-1、MCP-1的影响及其与血管平滑肌细胞损伤相关性，并在此基础上探讨复方七芍降压片的干预机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

15只3～4月龄的SPF级雄性SD大鼠，体重230～250 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司【SCXK(湘)2016-0002】，室温22℃、湿度50%，12 h光照/黑暗循环。实验动物伦理审批号(ZYFY2018112503)，由湖南省科技厅实验动物管理办公室审批实验动物环境设施合格证号【SYXK(湘)2015-0003】。

1.1.2 细胞

原代大鼠血管平滑肌细胞株和内皮细胞株均购于Procell公司。

1.2.3 主要试剂与仪器

复方七芍降压片(批号：20181026，规格：每片0.46 g)，人临床日用量为12片，相当于生药量97 g，购自湖南中医药大学第一附属医院制剂室。厄贝沙坦片(批号：17122111，规格：每片 75 mg)，人临床日用量为300 mg，购自扬子江药业集团北京海燕药业有限公司。

TNF-α 购 自 美 国 eprotech公 司， 批 号：101373A2918，P2Y6受体阻断剂MRS2578购自美国selleck公司，批号：S285501，IL-8 ELISA检测试剂盒购自上海晶天生物科技有限公司，批号：20190305，AP-1一抗、MCP-1一抗、β-actin内参抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司，批号分别为：AI03113818、AB05105689、AH11286487。

MK3型酶标仪(雷勃，芬兰)，电泳仪(BIORAD，mini protean 3 cell，美国)，离心机(Eppendorf，Centrifuge 5424 R 型，德国)，冰箱 (Haier，BCD-196TMZL型，中国)，全自动化学发光分析(上海天能科技有限公司，Tanon-5200型)，实验室超纯水(MilliPORE，ULUPURE 型，法国)。

1.2 方法

1.2.1 含药血清及对照血清的制备

SPF级雄性SD大鼠15只，根据体重随机分为3组，即空白对照组(5只)、厄贝沙坦片组(5只)、复方七芍降压片组(5只)。分别按临床等效剂量临床成人常用剂量3倍给予等体积蒸馏水、厄贝沙坦片(0.081 g/kg)和复方七芍降压片(1.50 g/kg)，灌胃。每天2次，连续给药7次。末次给药后2 h，腹主动脉取血于血清管中，离心10 min(4500 r/min)，取上清液，水浴灭活(56℃，30 min)，置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 细胞培养

将原代内皮细胞和平滑肌细胞分别于专用培养液(条件：5%CO2，37℃)中传代培养，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.2.3 共培养体系的建立

按细胞常规方法培养，将内皮细胞消化后接种至康宁24孔细胞培养板中，处于对数生长期的平滑肌细胞消化后接种至康宁Transwell小室内侧，置于细胞培养箱内(条件：5%CO2，37℃)，培养1～2 d后，即可成功构建内皮细胞和平滑肌细胞共培养体系[12]。

1.2.4 分组及给药

将共培养好的细胞随机分为7组，即正常对照组(A)：内皮细胞 +平滑肌细胞；模型组(B)：炎症因子+内皮细胞 +平滑肌细胞；空白血清对照组(C)：炎症因子+内皮细胞+平滑肌细胞+空白血清；MRS2578组(D)：炎症因子 +沉默内皮细胞 +平滑肌细胞；厄贝沙坦片含药血清组(E)：炎症因子+内皮细胞+平滑肌细胞 +厄贝沙坦片血清；复方七芍降压片含药血清组(F)：炎症因子 +内皮细胞+平滑肌细胞 +复方七芍降压片血清；MRS2578+复方七芍降压片含药血清组(G)：炎症因子 +沉默内皮细胞+平滑肌细胞 +复方七芍降压片血清。除A组外的共培养体系中加入10 ng/mL的TNF-α，构建模拟高血压炎症微环境，给药组加入10%的含药血清，其余各组加入等量空白血清，沉默内皮细胞为加入10 μm的MRS2578的内皮细胞，造模及给药干预24 h后进行相关指标检测。

1.2.5 细胞活力检测

采用CCK-8法检测各组平滑肌细胞及内皮细胞活性。弃孔内液体，然后加入完全培养基200 μL，同时每孔加入 10 μL CCK8 溶液，于细胞培养箱中继续培养3 h，最后用酶标仪于450 nm波长下测定各孔OD值，扣除板底值，并计算各组细胞的相对存活率。其中细胞存活率率＝给药组细胞存活率/正常组细胞存活率。

1.2.6 酶联免疫吸附剂测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测平滑肌细胞与内皮细胞共培养液中炎症因子IL-8的水平

收集平滑肌细胞与内皮细胞共培养上清液，离心15 min(3000 r/min)，取上清，按照ELISA试剂盒说明书，检测共培养体系中培养液中IL-8水平。

1.2.7 免疫荧光法检测内皮细胞中MCP-1、AP-1的蛋白表达

将共培养后的各组细胞，移去Transwell小室及孔内液体，冷PBS润洗，多聚甲醛固定30 min。用0.25%Triton-100通透15 min，滴加5%BSA封闭10 min，根据1∶100的体积比分别加入AP-1、MCP-1一抗稀释液，4℃避光孵育，PBS润洗。根据1∶400的体积比加入二抗稀释液，37℃避光孵育30 min，冷PBS润洗4次。滴加DAPI避光孵育15 min，PBS润洗4次。荧光检测并采集图像，并记录细胞平均荧光强度值。

1.2.8 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测内皮细胞中MCP-1、AP-1的蛋白表达

严格按照BCA蛋白检测试剂盒说明书操作，根据标准曲线求出每个样本的蛋白浓度。提取各组细胞蛋白，100℃变性后，SDS-PAGE电泳后采用湿转转膜，用含5%脱脂奶粉在室温封闭2 h。一抗孵育4℃过夜，PBST洗涤 5 min，3次。二抗孵育，PBST洗涤5 min，3次。取ECL发光液与膜的正面充分接触进行化学发光，置于全自动化学发光分析仪中曝光，通过TANON GIS软件读取相关蛋白的条带灰度值。

1.2.9 实时荧光定量法(qPCR)检测内皮细胞中AP-1、MCP-1 mRNA的表达

加入适量TRIzol试剂，离心12 000 rpm，5 min，取上清液加入200 μL氯仿溶液，剧烈振荡15 s后离心，取上清液，加入等体积的异丙醇溶液以沉淀其中的RNA，待RNA沉淀干燥后加入RNAse-fre溶液反复吹打使其完全溶解。按试剂盒说明书操作，逆转录合成cDNA，进行PCR反应。通过Primer 5.0软件设计引物，引物序列见表1。

表1 PCR各基因引物序列Table 1 Primer sequences of PCR genes

1.3 统计学分析

运用SPSS 21.0软件进行统计学分析。各组实验数据均用平均值±标准差()表示，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较用LSD检验。P＜0.05为差异具显著性。

2 结果

2.1 对内皮细胞及平滑肌细胞活力的影响

与A比，B组和C组内皮细胞及平滑肌细胞存活率明显降低(P＜0.01)，表明TNF-α介导的炎症微环境对细胞具有一定的损伤作用；与B组比，D组、E组、F组以及G组中的内皮细胞及平滑肌细胞存活率不同程度增加(P＜0.01或P＜0.05)。与D组比，G组内皮细胞及平滑肌细胞存活率增加(P＜0.05)。MRS2578和复方七芍降压片含药血清均能明显恢复炎症微环境损伤后的内皮细胞及平滑肌细胞活性(见图1)。

2.2 对平滑肌细胞与内皮细胞共培养液中炎症因子IL-8水平的影响

与A组比，B组和C组平滑肌细胞与内皮细胞共培养液中IL-8水平明显升高(P＜0.01)，表明TNF-α干预构建炎症微环境后会造成炎症因子IL-8分泌增加；与B组比，D、E、F、G组平滑肌细胞与内皮细胞共培养液中IL-8水平不同程度降低(P＜0.01或P＜0.05)；与D组比，G组IL-8水平降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。MRS2578和复方七芍降压片含药血清均能抑制炎症微环境损伤后炎症因子IL-8分泌增加(见图2)。

2.3 对内皮细胞中AP-1、MCP-1蛋白表达的影响

免疫荧光结果显示：与A组比，B、C组内皮细胞中 AP-1、MCP-1荧光强度值明显升高(P＜0.01)；与 B 组比，D、E、F、G 组内皮细胞中AP-1、MCP-1荧光强度值明显降低(P＜0.01)。与D组比，G组AP-1、MCP-1蛋白荧光强度值降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。复方七芍降压片能够抑制炎症因子诱导的内皮细胞中AP-1、MCP-1蛋白的表达水平，且与MRS2578合用时，这种抑制程度更加明显(见图3、4)。

图1 各组内皮细胞及平滑肌细胞活力比较(，n＝3)Note.Group A.Normal control group.Group B.Model group.Group C.Blank serum control group.Group D.MRS2578 group.Group E.Irbesartan tablet drug-containing serum group.Group F.Compound Qishao Jiangya tablet containing serum group.Group G.MRS2578+compound Qishao Jiangya tablet containing serum group.Compared with the normal control group，∗P＜ 0.05， ∗∗P＜ 0.01.Compared with the model group，#P＜0.05，##P＜ 0.01.Compared with MRS2578 group，▲P＜ 0.05， ▲▲P＜ 0.01.(The same in the following figures)Figure 1 Comparison of the viability of endothelial cells and smooth muscle cells in each group(，n＝3)

Western Blot结果显示：与A组相比，B、C组内皮细胞中 AP-1、MCP-1光密度比值明显升高(P ＜0.01)。 与B组比较，D、E、F、G组内皮细胞中AP-1、MCP-1光密度比值均明显降低(P＜0.01)。与D组比较，G组AP-1、MCP-1光密度比值明显降低(P＜0.01)。复方七芍降压片能够抑制炎症因子诱导的内皮细胞中AP-1、MCP-1蛋白的高表达，且与MRS2578合用时，作用更加明显(见图5、6)。

2.4 对内皮细胞中AP-1、MCP-1mRNA的影响

qPCR结果显示：与A组比，B、C组内皮细胞中AP-1、MCP-1mRNA表达水平均明显升高(P ＜0.01)。 与B组比较，D、E、F、G组内皮细胞中AP-1、MCP-1mRNA表达水平均明显降低(P＜0.01)。与D组比较，G组AP-1、MCP-1 mRNA表达水平降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。复方七芍降压片能够抑制炎症因子诱导的内皮细胞中AP-1、MCP-1mRNA的表达水平(见图7)。

图2 各组平滑肌细胞与内皮细胞共培养液中IL-8水平比较(，n＝3)Figure 2 Comparison of IL-8 levels in co-culture medium of smooth muscle cells and endothelial cells in each group( ¯x± s，n＝3)

图3 各组内皮细胞中AP-1、MCP-1蛋白表达比较Figure 3 Comparison of AP-1、MCP-1 protein expression in each group of endothelial cells

图4 各组内皮细胞中AP-1、MCP-1荧光强度值比较(，n＝3)Figure 4 Comparison of the fluorescence intensity value of AP-1 and MCP-1 in each group of endothelial cells(，n＝3)

图5 各组内皮细胞中AP-1、MCP-1蛋白表达比较Figure 5 Comparison of AP-1、MCP-1 protein expression in each group of endothelial cells

图6 各组内皮细胞中AP-1、MCP-1灰度值比值比较(，n＝3)Figure 6 Comparison of the gray value ratio of AP-1 and MCP-1 in each group of endothelial cells(，n＝3)

图7 各组内皮细胞中AP-1、MCP-1 mRNA水平比较(，n＝3)Figure 7 Comparison of the mRNA levels of AP-1 and MCP-1 in each group of endothelial cells(，n＝3)

3 讨论

复方七芍降压片是根据高血压病“肝肾阴虚、瘀血阻络”的发病特点，采用“养阴柔肝、化瘀息风”的立法组方而成。该方由三七、白芍、天麻、杜仲、丹参等11味中药组成。方中三七活血化瘀通络、白芍养阴柔肝息风，共为君药；天麻平肝息风、桑寄生、杜仲补益肝肾、丹参活血祛瘀，共为臣药；萝芙木平肝清热、葛根生津活血、地龙息风通络、炒香附理气疏肝，共为佐药；甘草为使，调和诸药；以上诸药合用使阴虚得补，阳亢得平，脉络得畅，髓海得濡、清窍得养、眩晕自止。现代药理研究发现：三七、天麻、丹参都具有扩张血管、减少外周血管阻力、增加血流量起到降低血压的作用[13-15]，白芍、杜仲能降低内皮素-1(endothelin-1，ET-1)和增加一氧化氮(nitric oxide，NO)浓度，改善内皮功能，调节血管重构，降低血压[16-17]。

血管平滑肌细胞和内皮细胞是血管中的两个重要组成成分，两种细胞之间存在肌内皮缝隙连接，允许电和小分子物质传递，在调节血管收缩和舒张功能中起重要作用[18]。内皮功能的损伤是发生血管重塑的始动环节[19]，在炎症因子TNF-α诱导的血管内皮细胞中，细胞存活率降低，凋亡细胞增多，内皮细胞大量分泌白介素6(interleukin-6，IL-6)、白介素 8(interleukin-8，IL-8)、TNF-α、MCP-1等前炎性因子，导致血管内皮细胞损伤，平滑肌细胞的增殖、迁移，组织纤维化而出现血管结构的改变[20-21]。刘雅蓉等[12]发现丹皮酚能减少血管内皮细胞炎性分泌的作用，影响血管平滑肌细胞中p38MAPK信号通路，最终抑制其凋亡。黄荷等[22]在内皮细胞-平滑肌细胞共培养体系中发现，内皮细胞的损伤可引起Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)炎症蛋白的表达增加，导致内皮细胞炎症反应加剧，平滑肌细胞增殖、迁移，进而诱发血管重塑。以上说明内皮细胞的损伤，可以导致其分泌炎症因子增加，作用于平滑肌细胞，影响血管舒张功能以及促进血管重塑。因此，研究内皮细胞对平滑肌细胞的影响，对保护血管正常功能和改善血管重塑有重要意义。建立内皮细胞-平滑肌细胞共培养体系，模拟体内细胞微环境，是目前研究内皮细胞和平滑肌细胞相互作用的理想模型[23]。本实验以TNF-α联合血管内皮细胞和血管平滑肌细胞共培养体系构建高血压炎症环境，观察内皮细胞炎症对平滑肌细胞增殖、迁移的影响。

AP-1是机体内一类重要的核转录因子，由c-Jun和c-Fos两个亚单位组成的AP-1异源二聚体最为典型。MCP-1属于趋化类细胞因子，是重要的促炎细胞因子，在单核细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等不同细胞中均有表达。内皮细胞中AP-1的两个亚单位c-Jun和c-Fos的激活可上调MCP-1的表达，促进多种炎症因子的分泌，引起血管平滑肌增殖、迁移，引发病理性血管重塑[24-27]。任卫琼等[28]通过抑制SHR大鼠肠系膜动脉中AP-1的活化，抑制MCP-1蛋白表达，能够降低炎症因子水平，抑制炎症反应，保护血管，改善血管重构。氧化低密度脂蛋白的内皮受体-1(lectin-like ox-LDL receptor 1，LOX-1)通过KLF2/AP-1途径介导内皮功能障碍和损伤，内皮功能的损伤进一步加剧内皮炎症反应，导致平滑肌细胞增殖、迁移，引发血管重塑[29-30]。李恒华等[31]发现葛根素联合丹参酮ⅡA通过有效抑制糖尿病大鼠主动脉中MCP-1、TNF-α的表达，减轻血管内皮炎症反应，增强对血管内皮的保护作用，促使平滑肌细胞功能修复，改善血管重塑。TNF-α通过诱导内皮细胞中AP-1蛋白的活化，可调控多种炎症因子的释放，导致内皮功能紊乱，加剧炎症因子的表达，促使血管平滑肌细胞异常增殖[32-33]；P2Y6受体阻断剂MRS2578是炎性蛋白的抑制剂，能够阻断TNF-α的炎性信号传递，抑制平滑肌细胞增殖，改善血管重构[34]。本实验研究结果显示，TNF-α诱导的血管内皮细胞和平滑肌细胞存活率明显降低，血管平滑肌细与内皮细胞共培养产生的炎症因子IL-8的含量增加，内皮细胞中AP-1、MCP-1蛋白表达和mRNA表达升高。给予药物干预后，复方七芍降压片含药血清组、厄贝沙坦含药血清组、MRS2578组、MRS2578+复方七芍降压片含药血清组内皮细胞及平滑肌细胞存活率增加，IL-8水平降低，内皮细胞中 AP-1、MCP-1蛋白及其mRNA的表达水平降低。提示，复方七芍降压片能恢复内皮细胞和平滑肌细胞活性，抑制炎症微环境损伤后细胞炎症因子分泌，降低内皮细胞中AP-1、MCP-1的活性，改善内皮损伤，保护平滑肌细胞正常功能，抑制血管重塑。

本实验研究发现，复方七芍降压片能够改善因炎症因子TNF-α诱导的内皮细胞及平滑肌细胞的存活率，抑制血管重塑，其机制可能与抑制IL-8的分泌，降低AP-1和MCP-1的活性，抑制内皮细胞炎症反应，改善内皮损伤，保护平滑肌细胞正常功能有关。