红细胞微粒与动脉粥样硬化相关性研究进展

郑国学, 谭 强, 郑江华, 陈 开

(川北医学院附属医院 血管外科, 四川 南充, 637000)

中国心脑血管疾病的患病人数正迅速增加，心脑血管疾病在中国农村和城市人口疾病死亡构成比中分别占44.60%、42.51%[1]。动脉粥样硬化(AS)是所有心血管疾病的共同病理基础，但目前关于AS在分子水平的发生和发展机制仍未完全阐明，主流的观点有脂质浸润堆积学说、慢性炎症损伤学说、血栓形成学说和自身免疫学说等[2]。细胞在老化或受刺激时会产生一些膜性小泡，其中直径40～100 nm的称为外泌体，直径100～1 000 nm的称为微粒。微粒表面含有部分原细胞的质膜成分，有些微粒内部甚至还含有从原细胞获得的部分细胞器，微粒主要功能是转移具有生物活性的蛋白质、脂质、核酸等，在细胞间起到信息传递作用。人体多种细胞均可产生微粒，由红细胞产生的微粒称为红细胞微粒(ErMPs)。目前有关微粒与AS关系的研究大多聚焦于白细胞微粒和血小板微粒，关注ErMPs的研究不多，但研究[3-5]表明, ErMPs可以通过促进凝血、参与炎症反应、调节内皮功能等多种途径影响AS发生和发展过程。本研究对ErMPs的形成、降解过程及其在AS中作用的研究进行综述。

1 ErMPs概述

1.1 ErMPs的产生和清除

当红细胞遭遇补体攻击、凋亡信号刺激、剪切应力损伤等因素作用时，磷脂促翻转酶被激活，原本位于细胞膜内层的磷脂酰丝氨酸(PS)翻转至外层，膜磷脂层不对称性和原本正常的电荷分布被破坏，红细胞膜的稳定性随之被破坏，最终以出芽的方式形成微粒[6]。启动ErMPs形成的具体机制尚不清楚，可能与细胞内钙离子摄入增加、钾离子外流增多、三磷酸腺苷(ATP)消耗以及红细胞内其他能量衰竭引起的级联反应有关[5]。红细胞不同于其他细胞的特殊之处在于其含有丰富的血红蛋白，在血红蛋白与氧气结合/分离过程中，少许不正常的含氧血红蛋白分子通过电子转移产生过氧化物(如高铁血红蛋白)以及其他活性物质，这些过氧化物不仅会损伤血红蛋白使其失活，还会损伤细胞骨架、膜蛋白和膜脂质成分[7]。研究[6]指出，细胞表面的氧化损伤可以触发带-3蛋白(一种跨膜氯/碳酸氢盐离子交换蛋白，可与细胞骨架结合参与维持红细胞膜稳定)酪氨酸磷酸化，导致带-3蛋白与细胞骨架分离，引发细胞膜出芽形成微粒。

ErMPs的清除也与PS密切相关，循环中的单核-巨噬细胞和肝库普弗细胞可特异性表达PS受体，与ErMPs表面的PS结合后触发其降解ErMPs。ErMPs表面的PS也可与发育内皮基因座1(一种内皮细胞来源的整合素配体蛋白质)的产物结合从而被内皮细胞吞噬并清除[8]。研究[9]指出部分ErMPs不表达PS, 因此这部分ErMPs的清除机制尚不明确。

1.2 ErMPs的结构特点

ErMPs直径较单个核细胞、血小板等细胞产生的微粒直径稍小, 200～250 nm[3]。ErMPs的3种主要形状为球形、管形和碎片状，以球形为主。ErMPs的具体成分与“母体”红细胞所受刺激有关[9], 主要成分有血红蛋白、脂质、与红细胞相关的部分抗原和结构蛋白，这些成分有助于ErMPs发挥各种生物学效应，成分不同的ErMPs的生物学活性也不同。红细胞在其整个生命周期中大约会损失20%的血红蛋白，这些血红蛋白大多被ErMPs包裹带走[10], ErMPs中的血红蛋白在参与炎症反应及损伤内皮细胞等方面具有重要作用[4, 11]。ErMPs中的脂质主要以特异性脂筏的形式存在，这些脂筏主要由Stomatin样蛋白和糖基化磷脂酰肌醇连接蛋白(GPI)组成。ErMPs的磷脂种类与完整红细胞基本相似但含量不同，其磷脂酸含量是红细胞的10倍，磷脂酰乙醇胺含量较红细胞膜稍低; 由于不含血影蛋白(红细胞膜蛋白的主要成分), ErMPs的膜蛋白含量只有红细胞的一半，此外ErMPs还含有可溶性耐药相关钙结合蛋白和会联蛋白[12]。

1.3 ErMPs的检测

近年来, ErMPs在输血相关并发症、动脉粥样硬化、慢性病性贫血等疾病中的作用越来越受到关注，相关的研究报道逐渐增多。由于直径较小，检测容易受样本中尺寸相近的其他颗粒影响，因此目前仍没有检测和分析微粒的标准方法。目前常用的方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、流式细胞学术(FCM)、电子显微镜观察、蛋白组学法、动态光散射、纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)等。ELISA灵敏度高、操作简单，但是无法区分底物的大小，且容易受试剂中可溶性小分子抗原的干扰; FCM因速度快、精度高、准确性好、可定量检测等优势，已经成为目前最有效的微粒检测技术，但传统的FCM只能检测直径大于300 nm的微粒, FEDOROV A等[13]运用高灵敏度FCM结合低压扫描电子显微镜，检测出了最小直径约25 nm的血小板微粒，大大提高了检测的灵敏度和分辨率。NTA的核心原理是使用激光能量集束透过特殊棱镜照射样本溶液，再利用显微镜观察颗粒在溶液中的运动，从而进行测定和分析，因分辨率高，也开始用于微粒的检测[14]。有学者[15]对比研究FCM、NTA、电子显微镜技术等5种广泛用于微粒检测的方法，结果显示使用改良的FCM可区分出最小约150 nm的微粒, NAT最小可检测出直径70～90 nm的细胞微粒。

2 ErMPs与AS

AS因其发生、发展机制复杂，长期以来一直是心血管疾病研究的热点和难点，动脉内膜损伤和多种炎症因子介导的内膜下脂质沉积一直被认为是AS的始发环节，斑块内微血栓形成、慢性炎症反应、免疫调节等过程均在AS进程中发挥作用。ErMPs可通过上述一种或多种途径直接或间接参与AS过程。

2.1 促进凝血

斑块破裂和随后继发的血栓形成是AS发病的重要病理改变，破裂斑块释放进入外周血的ErMPs在其后的血栓形成事件中可能发挥重要作用。众所周知，糖尿病是AS的独立危险因素, GKALIAGKOUSI E等[16]研究发现2型糖尿病患者外周血ErMPs数量明显高于对照组，提示ErMPs能促进2型糖尿病患者AS早期血栓形成。SUADES R等[17]研究显示，急性冠状动脉综合征(ACS)患者外周血中ErMPs含量较健康人明显升高，提示ErMPs参与了冠状动脉粥样硬化基础上的急性血栓形成事件。程庆荣等[18]研究也发现ErMPs是冠状动脉血管病变严重程度的独立危险因素。ANTONOVA O A等[3]使用PS阻滞剂和抗组织因子抗体研究PS和组织因子对ErMPs的促凝机制，发现PS阻滞剂能完全阻断所有ErMPs的凝血活性，但在ErMPs中未检查出组织因子活性，得出结论ErMPs只能通过外翻的PS激活内源性凝血途径发挥促凝作用，而与外源性凝血途径无关。朱跃跃等[19]研究结论与上述结论基本一致。有研究者[20]使用ErMPs刺激健康志愿者的血液后发现，其外周血中单核细胞及血浆中组织因子表达增加，活性明显提高，提示ErMPs可能通过外源性途径启动凝血过程，因此ErMPs启动凝血的具体机制尚不明确。

虽然不同研究结论不一致，但均证明ErMPs具有强烈促凝作用, ErMPs的促凝活性与其膜表面暴露的PS密切相关。正常的红细胞膜中, PS位于磷脂双分子层的内层，磷脂的分布具有不对称性，且这种不对称性需要不断消耗细胞能量来维持。但在ErMPs形成过程中，这种不对称性已经被破坏，且微粒本身无法产生能量，因此PS外翻至磷脂膜外层，而PS是带负电荷的生物大分子，外翻暴露后可以与带正电荷的凝血因子XII结合，启动内源性凝血途径[21]。研究[22]报道，ErMPs促进凝血是通过激活XI因子为起始步骤的。PS还可以通过与血小板膜上的CD36受体结合，诱导二磷酸腺苷(ADP)相关的血小板活化而参与凝血[23]。研究[24]指出ErMPs具有抗凝效应，提示ErMPs可能在特定环境下表现出一定的抗凝活性，但绝大多数研究均证明ErMPs具有促凝作用，其在AS疾病进程中的促进斑块破裂后的血栓形成作用已经被广泛证实，但其触发凝血途径的始发环节和在凝血过程的具体作用仍未完全阐明。

2.2 促进炎症反应

AS是血管壁的一种慢性炎症反应过程, ErMPs可以通过多种途径参与其中，其促炎作用主要通过以下2种机制实现: 一方面, ErMPs本身的膜结构可促进炎症介质的产生。ErMPs膜上的PS可以促进微粒向巨噬细胞移动，因为巨噬细胞表面有PS受体表达，它们结合后产生超氧负离子，进而激活核因子Kappa B(NF-KB)和应激活化蛋白激酶(SAPK)介导的炎症通路，并最终生成肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)等炎症因子，同时引起内皮细胞高表达血管细胞黏附分子-1(VCAM-1), 提高炎症细胞对内皮细胞的黏附性[25]。斑块中的微粒膜表面还可表达一种含有去整合素-金属蛋白酶-17(ADAM-17)结构域的活性蛋白(这些微粒部分由红细胞产生), ADAM-17的活性形式可以促进含有促TNF原裂解位点的拟肽水解，生成包括TNF、TNF受体-1(TNFR-1)、内皮细胞蛋白C受体(EPCR)等信号分子[23, 26]，参与血管内皮的炎症反应。内皮细胞-白细胞黏附分子(ELAM-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)被炎症因子或者其他有害信号分子刺激后会在血管内皮细胞大量表达，白细胞可通过自身表面的ELAM-1和ICAM-1配体与内皮细胞结合，从而渗透进入血管内皮下间隙发挥抗炎效应。CHANG A L等[4]用从小鼠体内提取浓缩红细胞制备的ErMPs分别进行体内和体外实验，证明了ErMPs在体内、体外均可诱导内皮细胞表达ELAM-1、ICAM-1和IL-6, 促进炎症反应。ErMPs也可以通过放大单核细胞趋化因子、P-选择素等炎症因子的作用，以及提高C反应蛋白(CRP)水平等多种途径参与炎症反应[27]。

另一方面, ErMPs内含的血红蛋白可促进AS病灶中的炎症反应。含血红蛋白是ErMPs与其他细胞微粒的不同之处，粥样斑块中的微粒释放出血红蛋白可以为斑块提供游离胆固醇。血红蛋白通过与一氧化氮(NO)和某些活性脂质相互作用转变为高铁血红蛋白及铁基血红蛋白，这些物质可以促进斑块中低密度脂蛋白的氧化作用，从而加强内皮细胞的炎症反应，促进AS发展。此外，铁基血红蛋白还能作为内皮细胞的促炎激动剂，提高内皮细胞的通透性和黏附性[11]。SADALLAH S等[28]在体外实验中发现, ErMPs能通过抑制酵母多糖A与脂多糖对巨噬细胞的活化作用从而抑制巨噬细胞活化，进而抑制TNF-α、IL-8等炎症因子的释放，但该研究不是在AS病理条件下进行的，因此无法有效证明ErMPs在AS特定微环境下是否仍有抗炎活性。总之，关于ErMPs对炎症反应的影响目前还未达成一致，值得深入研究，但多数研究认为ErMPs能促进AS病灶中的炎症反应。

2.3 调节血管内皮功能

内皮细胞在维持血管系统生理功能中起着至关重要的作用，其功能异常在AS整个病理进程中均可观察到。ErMPs可以促进内皮细胞表达ELAM-1、ICAM-1等信号分子[4]，从而促进其与炎症细胞的黏附。向镰刀形细胞性贫血小鼠模型(SAD)体内输注ErMPs后，观察到ErMPs能与SAD小鼠肾血管内皮细胞黏附促进肾动脉血栓形成，快速引发小鼠肾血管阻塞[29], 说明ErMPs不仅能通过促进黏附分子表达来增强内皮细胞黏附性，也能直接作用于血管内皮细胞，影响其生理功能。镰刀型细胞性贫血患者循环中约1/3的非红细胞性血红蛋白是与ErMPs结合在一起的[5]。来源于镰刀状红细胞的微粒可以增强红细胞与内皮细胞之间的黏附性，这可能也与其膜上外翻的PS有关，因带负电荷的PS能很好地与带正电荷的血红蛋白结合。与内皮细胞结合后，ErMPs将血红蛋白转移到内皮细胞中，激发氧化应激和细胞凋亡。ErMPs激活内皮细胞的具体机制尚不完全清楚, KIM Y等[30]证实内皮细胞可通过Rab5信号蛋白通路介导的内吞作用摄入ErMPs并导致其自身活化，并且经过ErMPs处理的内皮细胞表现出ICAM和E-选择素以及IL-6的表达增加，提示ErMPs可通过Rab5信号通路活化内皮细胞。

另外, ErMPs还可通过消耗NO来调节内皮细胞功能，NO是内皮细胞产生的一种内源性舒血管因子，具有调节血管舒缩、抑制单核细胞和血小板定向聚集黏附、抑制血管平滑肌增生以及降低血小板活化等作用，是一种重要的AS保护因子。刘洪智等[31]研究发现，与对照组相比，AS模型兔体内诱导型一氧化氮合酶(NOS)活性显著降低, NO生成明显减少。NO可与氧合血红蛋白反应生成硝酸盐和高铁血红蛋白而被清除, ErMPs与NO结合的能力约为细胞内血红蛋白的700倍[32], 因此ErMPs会大量消耗NO, 降低其生物利用度，间接促进AS的发展。

2.4 调节免疫反应

大量研究[2, 33]证实，在AS发生和发展的所有阶段，粥样斑块内都存在着包括巨噬细胞、淋巴细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)在内的多种免疫细胞, ErMPs对免疫系统的调节作用就表现为调节免疫细胞活化和细胞因子的释放。事实上，这些免疫细胞和细胞因子大部分也都参与了AS的炎症反应过程。在AS早期阶段，沉积于血管内皮下的脂蛋白刺激血液中的单核-巨噬细胞向内皮下移动，进入内皮下的单核-巨噬细胞通过清道夫受体介导吞噬脂质后转变为泡沫细胞。此外，作为动脉粥样斑块中的主要效应细胞，巨噬细胞可以分泌细胞因子来驱动AS病灶中的炎症反应过程[25]。SADALLAH S等[28]研究结果提示ErMPs可通过抑制巨噬细胞的活性表现出一定抗AS活性，但也有研究者[34]发现ErMPs可以促进巨噬细胞产生促炎性细胞因子(IL-2、IL-7、IL-15、和TNF-α), 其还发现直径<200 nm的微粒(不论其来源)可以通过与抗原提呈细胞的相互作用来增加CD4+和CD8+T细胞的增殖。由此可见, ErMPs对免疫系统的影响似乎既有促进也有抑制作用，这些研究之所以得出不同甚至完全相反的结论，可能与研究者所用的ErMPs的来源及制备方法不同有关。再者，从颈动脉粥样硬化患者的粥样硬化斑块中检测到NK细胞表面活化受体NKG2C表达明显增加[35], 提示NK细胞在AS中有一定促进作用。YE W J等[36]研究显示，疟疾感染者体内的ErMPs可通过黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)通路激活NK细胞，该研究虽并未提及，但可以推测ErMPs可能通过同样或类似的机制激活动脉粥样斑块中的NK细胞从而促进AS发展。

3 结 语

AS是临床各种心血管疾病最基础的病理变化，但其具体发病机制尚未研究透彻。随着世界人口老龄化程度加剧，全世界人群心血管疾病发病率不断升高，从根本上弄清AS的发生和发展过程并找出具有临床意义的干扰靶点就显得尤其重要。越来越多的研究表明, ErMPs通过促进血栓形成、促进炎症反应、改变内皮细胞功能、调节免疫反应等多种途径直接或间接影响AS进程，甚至可能在其中发挥重要作用。但也有少部分研究[24, 28]指出ErMPs具有抗凝与抑制抗炎的效应，因此作为一种潜在的新型生物标记物, ErMPs的生理功能和其在AS疾病中的作用还需更深入的研究，例如不同病理生理环境下产生的ErMPs功能是否不同、ErMPs在AS基础上的急性缺血事件中是否有预测作用等问题依然需要解决。若能实现其在AS特定微环境下的稳定性抗凝和抗炎作用，也许能为干扰甚至逆转AS疾病进程提供新的途径。