类风湿性关节炎与一氧化氮及其合成酶的相关研究进展

刘雅珺，杨树龙

(南昌大学基础医学院生理教研室，南昌 330006)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，其特征在于反复发作的关节滑膜炎症导致关节和软骨发生不可逆性损伤甚至残疾，并最终引起心血管和肺部疾病等一系列全身并发症。一份流行病学报告数据显示，RA的全球患病率为0.24%[1]，而在中国，其发病率为0.19%～0.41%，女性患RA的可能性是男性的4倍[2]。目前有关RA的文献中，该病发病机制通常为遗传易感性和环境因素之间复杂的相互作用；机体固有免疫和适应性免疫系统被反复激活，破坏了其免疫耐受性；自身抗原呈递和抗原特异性T细胞和B细胞活化失常，由此引发关节滑膜增生和骨质破坏，进一步导致关节肿胀、畸形以及全身性炎症[3]。RA的发病机制及疾病进展复杂且尚未明确，众多研究表明NO及其合成酶参与其中。本文就RA与一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthases，NOS)的相关研究进展作详细综述。

1 NO及NOS

NO是人体内一种不稳定的自由基气体小分子，由NOS催化L-精氨酸(L-arginine，L-Arg)产生，在维持机体多个系统的生理功能中起重要作用[4]。关节内软骨组织是合成NO以及NOS的主要部位,其次是滑膜组织[5]。各项研究发现NO对机体的利弊影响取决于其浓度，浓度过高的NO在RA患者的炎症关节介导许多不同的细胞功能，包括细胞因子产生，线粒体功能和炎症关节软骨损伤等。

迄今为止已知NOS有不同基因编码的3种同工酶，即神经型(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)、内皮型(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和诱导型(inducible nitric oxide synthase，iNOS)。nNOS和eNOS又称为组成型(constitutive nitric oxide synthase，cNOS)，是神经元、平滑肌和内皮细胞中正常存在的一种催化酶，其活性依赖于钙离子。当钙离子浓度升高时，瞬间产生少量的NO，发挥神经传递、血管舒张、瞬时血压调节等作用。iNOS存在于巨噬细胞、淋巴细胞和内皮细胞等，通常是在炎症和免疫刺激下表达，不依赖于钙离子的浓度，能够快速催化产生高浓度的NO且维持时间较长，发挥其免疫调节、炎症以及毒性作用。

2 RA与NO的相关研究进展

各项研究表明，RA患者的血液和滑液中NO含量明显增高且滑液含量远高于血液，活动期远高于非活动期和正常情况。

2.1 NO与免疫细胞

NO是最重要的先天免疫系统成分之一。人体内的NO除血管内皮细胞外，可由多种免疫细胞如树突细胞，NK细胞，巨噬细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞和中性粒细胞产生，同时绝大部分免疫细胞参与并介导了RA。NO在RA的发病机制中起核心作用，尤其是NO介导的免疫功能障碍[6]。

2.1.1 NO与T淋巴细胞

RA是T淋巴细胞介导的系统性自身免疫疾病，诸多证据表示NO在正常情况下可调节T细胞的生理作用，而RA患者体内NO的过量产生则会导致T细胞功能障碍。据目前的研究推测活动性RA可能由Th1/Th2、Th17/Treg细胞比例失衡导致。

NO可调节人T细胞中的线粒体膜电位和人淋巴细胞中的线粒体生成，NO通过调节线粒体活化T细胞后，各种炎性细胞因子和趋化因子的分泌增多，Th1/Th17细胞上调[7]，这意味着Th1/Th2、Th17/Treg细胞平衡被打破。其中Th1/Th2失衡在慢性炎症性疾病必不可少，Th-2细胞表达广泛的抗炎细胞因子的能力，具有保护作用，而NO会选择性加强Th1细胞的增殖。而Th17细胞上调会介导T细胞激活，其参与了RA发病的起始和关节骨组织破坏两个阶段[8]。Tregs细胞具有保护作用，其标志性细胞因子白介素10(Interleukin 1，IL-10)的升高可以抑制Th1细胞增殖并且下调其活性[9]。BRAHMACHARI等[10]指出RA中Treg细胞衰减可能受NO的调控。RA动物模型即CIA模型小鼠体内缺乏Treg细胞已被证明可增加细胞和体液免疫反应和小鼠患病严重程度[11]。

2.1.2 NO与巨噬细胞

NO在自我保护的炎症和免疫反应中起重要作用，而过量产生NO可能导致组织损伤。在RA中，活化的巨噬细胞会产生过量的NO[12]。NO大量产生，诱导滑膜血管生成和增生，促进滑膜病变，这也可表明持续感染可能是部分动物模型发生滑膜炎和关节炎的原因。巨噬细胞可产生NO参与免疫防御系统以抵御病原体和微生物，经鼠腹腔或静脉注射脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)可使关节局部NO浓度显著增高，最终诱发大鼠关节炎。LPS、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等还可诱导巨噬细胞合成环加氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)和iNOS，另外如IL-4，IL-10和转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)，可以下调巨噬细胞中NOS的合成[13]。

2.2 NO与细胞因子网络

细胞因子常处于相对平衡而并非是某个绝对浓度，细胞因子比例可能影响最终所起的促炎与抗炎作用。调节促炎细胞因子可有效控制RA，表明维持细胞因子平衡可作为全身免疫抑制的治疗策略。有研究[14]表明，NO明显抑制IL-1刺激内皮细胞所表达的VCAM-1和选择素(E-selectin)，抑制白细胞贴壁和渗出，可推测在炎症最早期NO可能主要起保护作用，但在炎症后期，由于滑液中多种炎性细胞因子浓度显著提高,诱导合成大量的NO，直接加重滑膜的损伤。根据对NO作用方向可分为两类:一类可上调NO合成,如TNF-α、IL-1等;另一类可下调NO合成,如IL-4、IL-10等。

IL-17是一种促炎性T细胞细胞因子，诱导成纤维细胞，软骨细胞，成骨细胞，滑膜细胞，巨噬细胞分泌促炎细胞因子如TNF-α，IL-6，IL-1β，其被证明参与关节炎的多种过程，包括血管增殖，破骨细胞生成，白细胞聚集和炎症发生[15]。IL-17在RA关节中大量表达，在RA中发挥主要的病理作用，诱导促炎细胞因子以及前列腺素、MMPs的产生，研究表明中和IL-17可防止关节炎的发展[16]。除此之外还独立作用或与其他细胞因子共同作为iNOS的有效激活剂[17]。TNF-α是RA病理过程后期的关键介质并被认为是影响RA严重程度的因素之一，而IL-1β与RA发病率增加有关[18-19]，二者均可上调软骨细胞和骨关节炎滑膜细胞中的NO。RA患者的滑膜组织中发现TNF-α、IL-1β均处于高水平，其通过上调COX-2和NOS的表达，从而增加炎症介质如前列腺素和NO的产生[20]，加重局部炎症反应。

IL-10具有强大的抗炎功能，可抑制Th-1细胞增殖，减少炎性细胞浸润[21]。IL-10主要作为转换因子将IgM转化为IgG或IgA减少CIA大鼠关节中促炎细胞因子的产生和软骨退化[22]。有研究表明IL-10在体外和体内产生的抗炎和抗关节炎作用很大[23]。IL-4具有抗炎作用，可抑制巨噬细胞的功能，同时还可以抑制滑膜细胞增殖[24]。IL-4是诱发驱动Th2细胞的主要细胞因子，其抗炎作用部分是通过抑制NO来介导的[25]，但其多种功能的动态平衡决定了其对特定免疫应答的总体影响。

2.3 NO与软骨损伤

RA的一个关键特征是关节软骨丢失。软骨细胞凋亡和软骨细胞外基质降解由促炎细胞因子(如IL-1)，炎症介质和MMPs等的复杂相互作用介导[26]，而NO不仅在疾病活动中起作用，也是关节炎中涉及软骨功能障碍的介质之一，在关节损伤中同样有重要作用[27]。MMP-13也可能是RA发病机制的一个原因，除了其直接的组织降解作用外，它在MMP激活级联中具有中心位置[28]，且能够加剧血管增殖。MMP-13被炎性细胞因子如IL-1、IL-6、TNF和IL-17上调，NO可间接增加MMP-13的表达和活性。

滑膜细胞和软骨细胞能够在细胞因子刺激后产生高水平的NO[29]，这表明NO可能参与RA的炎症过程与关节破坏。滑膜细胞侵袭和增生血管的内皮细胞产生的NO会影响骨重建、软骨基质的产生和软骨代谢,引起骨和软骨的损害[30]。如前所述，NO可增强细胞因子诱导的骨吸收，同时其高水平也可抑制骨形成。因此，RA发炎关节内产生的NO可能导致关节周围骨质流失。

3 RA与NOS的相关研究进展

NO是由NOS在氧分子的参与下催化L-Arg产生的，参与哺乳动物的多种生理病理过程，其合成酶NOS也涉及多种疾病。nNOS过量产生NO，将有可能引发包括急性(脑卒中)和慢性(精神分裂症，阿尔茨海默症，帕金森症)神经退行性疾病，抽搐和疼痛；iNOS过量产生NO已经证明涉及各种病理过程，包括感染性休克，炎症导致的组织损伤和类风湿性关节炎[31]。

3.1 iNOS与RA

通常情况下iNOS的表达由细胞因子，微生物或肿瘤细胞产物引发，且主要发生在免疫反应期间，iNOS在LPS、IFN等各种刺激下，催化L-Arg生成NO[32]。MARTIN等[33]认为，RA患者滑膜中的滑膜衬里细胞和间质细胞均可高表达eNOS和iNOS，iNOS的表达可能参与关节炎的诱导，该文献通过西班牙西北RA患者与对照组之间iNOS启动子多态性基因型频率的显著差异表明iNOS启动子多态性在RA易感性中具有潜在作用。同时体外实验[34]表明，滑膜细胞和软骨细胞的凋亡和iNOS表达有关，这意味着iNOS活化可通过抑制骨形成和促进成骨细胞凋亡而促成炎症诱导的骨质疏松症。

3.2 eNOS与RA

RA的临床病理进程和遗传因素之间的联系值得研究，探讨与之相关的基因可能是一个方向。eNOS由位于染色体7q35-36上的基因编码，该基因具有3种常见的多态性：启动子区域的T-786C，eNOS第7外显子894G和eNOS基因4内含子中27 bp，它们可能与许多疾病的发展相关[35]。eNOS基因多态性成为了影响RA易感性的一个因素。VAZGIOURAKIS等[36]研究eNOS基因第4内含子VNTR多态性对居住在克里特岛的患者RA易感性的影响，其结果表明eNOS基因a/b多态性可能是RA的易感基因。

AN等[37]研究显示，eNOS基因的几种遗传多态性与RA的发病机制有关。其研究目的是研究eNOS基因的两个T-786C和G894T SNP的等位基因是否与中国北方人群的类风湿性关节炎风险相关，其结果表明具有T-786CC基因型的个体可能患类风湿性关节炎的风险增加。BUNJEVACKI等[38]研究显示，eNOS基因多态性影响了疾病活动，原因可能是786TT/786CT和786CC基因型在所有3个参数方面存在统计学显著差异，从而得出TT和CT基因型可能导致RA更严重的临床表现的结论。

为了检查eNOS基因的启动子区域的T-786C与RA易感性和临床表现之间的内在联系，有人对西班牙与欧洲后代患者进行研究，该研究还以南巴西欧洲后裔群体进行病例作为对照[39]，其结果并未证实T-786C多态性与RA之间存在任何关联。这可能反映了eNOS多态性频率的种族间差异，可能背景因素(遗传和其他)分化群体可以改变基因的表达。BRENOL等[40]在研究中发现，eNOS基因的T-786C多态性与RA的关节外表现之间存在关联，然而该研究结果并未对eNOS基因T-786C在RA易感性中的主要作用提供支持。现有证据的基础上,难以确定不同eNOS多态性在RA中的真正作用。

另一方面，eNOS对血管稳态至关重要，可参与多种疾病内皮功能障碍的发病机制。有研究表明eNOS基因编码可能影响NO在血液中的含量[41]。

3.3 nNOS与RA

在神经元细胞中，NO控制神经递质的释放，并参与突触发生，突触可塑性，记忆功能和神经内分泌分泌。有研究[42]发现，关节炎诱导的肌肉无力是因为减少肌原纤维力的产生，这可能是肌动蛋白亚硝化应激水平升高的结果，而其原因可能是nNOS和钙离子的增加。另一篇文献[43]对CIA小鼠也做了研究，结果显示小鼠肌收缩功能受损，nNOS表达显著增加而iNOS或eNOS表达没有显著增加。nNOS在RA的疾病表现中可能起到部分作用。

4 结语

RA作为一种临床上致残率较高的慢性自身免疫性疾病，其病理表现为滑膜增生、新生血管生成、软骨破坏等，并涉及其他多个系统。NO在滑膜炎症部位介导许多不同的细胞功能，包括炎性细胞因子产生，线粒体功能和炎症关节软骨损伤。NO以及NOS在炎症组织中的过度表达提示抑制过量的NO合成和使用NOS抑制剂可作为治疗RA的方法，且NOS抑制剂可逆转几种典型的炎症症状(红斑和血管渗漏)。但NO及其合成酶NOS在RA病理进程中的具体作用以及如何抑制NO合成、NO对炎性关节各细胞如何作用等仍需进行更深入的探索。