响应面法优化超声辅助提取黄瓜多酚工艺及其对酪氨酸酶的抑制作用

陈建福 林洵 陈仲巍

摘    要：为确定超声辅助提取黄瓜多酚的最佳工艺条件，并评价黄瓜多酚对酪氨酸酶的抑制作用，以黄瓜为原料，以多酚提取率为响应值，对影响响应值的超声时间、液料比、乙醇含量和超声温度4个因素进行单因素和响应面优化试验，并考察了黄瓜多酚对酪氨酸酶的抑制作用。结果表明，所考察的各工艺条件对黄瓜多酚提取率影响的顺序为：超声温度>乙醇含量>液料比>超声时间。提取工艺的最佳条件：超声时间为30 min，液料比为27 mL·g-1、乙醇含量（φ，下同）为64%、超声温度为68 ℃，在此条件下，黄瓜多酚提取率为11.33 mg·g-1。黄瓜多酚对酪氨酸酶具有一定的抑制作用，且多酚浓度与酪氨酸酶抑制率存在量效关系，表明黄瓜多酚可作为天然的酪氨酸酶抑制剂，是一种潜在的天然美白添加剂，为黄瓜多酚的提取与开发提供新的方向。

關键词：黄瓜;多酚;超声辅助提取;酪氨酸酶;抑制

中图分类号：S642.2 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）12-016-07

Abstract： The aim was to determine the best process conditions of ultrasound-assisted extraction of cucumber polyphenols， and to evaluate the inhibitory activities of cucumber polyphenols on tyrosinase. The single factor experiment and response surface methodology were performed on the four factors involving ultrasonic time， liquid-to-material ratio， ethanol concentration and ultrasonic temperature using cucumber as raw material and the extraction yield of polyphenols as the response value. Inhibition effect of cucumber polyphenols on tyrosinase was also examined. The results showed that the significant order of the effects of the investigated technological conditions on the extraction yield of cucumber polyphenols was as follow： ultrasonic temperature， ethanol concentration， liquid-material ratio and ultrasonic time. The optimal conditions for the extraction process were： ultrasonic time 30 min， liquid-material ratio 27 mL·g-1， ethanol concentration 64% and ultrasonic temperature of 68 ℃. Under these conditions， the cucumber polyphenol extraction yield was11.33 mg·g-1. Cucumber polyphenols had a good inhibitory effect on tyrosinase and there was a dose-effect relationship between the concentration of polyphenols and the tyrosinase inhibition rate. It indicated that cucumber polyphenol could be a natural tyrosinase inhibitor and a potential natural whitening additive， which provided a new direction for the extraction and development of cucumber polyphones.

Key words： Cucumber; Polyphenol; Ultrasonic-assisted Extraction; Tyrosinase; Inhibitory

黄瓜（Cucumis sativus L.），又名青瓜、刺瓜、胡瓜等，为葫芦科黄瓜属一年蔓生或攀缘草本植物，是世界十大蔬菜作物之一[1-2]。黄瓜果肉脆爽，水分充足，生食解腻清爽，在我国果蔬市场上占有不可替代的地位。黄瓜中含有的蛋白质、葫芦素C、胡萝卜素、多酚、多糖等天然有效成分，具有清热排毒、提高人体免疫力、加速人体新陈代谢等作用[3-4]。其中，多酚是一种存在于植物体内结构复杂、化学性质活泼的多羟基类化合物，在化妆品领域具有美白、防晒、抗衰老、收敛、保湿等作用[5-6]。

酪氨酸酶是一种含有双铜离子的金属氧化酶，是与人体合成黑色素密切相关的限速酶，因此，可以通过抑制酪氨酸酶的活性来达到美白的作用[7]。随着人们生活水平的提高，具有天然美白活性成分的化妆品越来越受到国内外消费者的青睐，开发天然新型的酪氨酸酶抑制剂成为研究热点[8]。超声波辅助提取法是一项新型的天然产物辅助溶剂提取技术，能大大提高有效成分的提取率，同时具有耗时短、操作简便、有效成分损失少等优点，具有良好的应用前景。笔者以黄瓜为材料，考察了超声时间、液料比、乙醇含量和超声温度等工艺因素对黄瓜多酚提取率的影响，并用Box-Behnken对工艺过程进行设计，优化得到最佳的工艺条件，并考察了黄瓜多酚对酪氨酸酶的抑制作用，以期为黄瓜多酚的开发与利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验于2019年10—12月于福建省漳州市漳州职业技术学院成业楼食品工程实验室进行。黄瓜为上海种都种业科技有限公司选育的密刺型黄瓜亮美1号;乙醇为食品级，由河南鑫河阳酒精有限公司提供;蘑菇酪氨酸酶，由Worthington公司提供（700 U·mg-1）;没食子酸由天津市瑞金特化学品有限公司提供（分析纯）;曲酸，由德国Ruibio公司提供;L-酪氨酸由国药集团化学试剂有限公司提供;其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 多酚含量的测定 采用福林-酚法[9]，以没食子酸作为标准物质，测定多酚的含量，配制100 mg·L-1没食子酸标准溶液，在10 mL的比色管中分别加入一定体积的没食子酸标准溶液，然后各加入0.5 mL福林-酚试剂和1.5 mL质量分数为20%的碳酸钠溶液，摇匀后定容，后于75 ℃水浴环境中反应10 min，取出冷却，测定出765 nm处溶液的吸光度。以吸光值为纵坐标，没食子酸质量浓度（mg·mL-1）为横坐标，作图并线性回归得：Y=85.196X+0.01（R2=0.999 1）。

1.2.2 黄瓜多酚的提取工艺 把黄瓜用清水浸泡10 min清洗，再用蒸馏水进行清洗，滤干后去皮去籽，在50 ℃烘箱中烘烤干，磨成粉后备用。将质量为m（g）的黄瓜粉末装入烧瓶中，按照所考察的工艺条件加入乙醇溶液，然后置于超声波中进行提取，结束后过滤、定容。

1.2.3 黄瓜多酚提取率的测定 在定容体积为V（mL）的提取液中，用移液枪准确移取一定量的黄瓜提取液，按1.2.1中多酚含量的测试方法，测定出765 nm处黄瓜多酚溶液的吸光值，代入没食子酸标准曲线，计算出多酚的质量浓度ρ（mg·mL-1），用下式计算得出单次黄瓜多酚提取率，每个试验3次重复，计算均值，即得黄瓜多酚提取率。

黄瓜多酚提取率/（mg·g-1）=[b×Vm]。

1.3 試验设计

1.3.1 单因素试验设计 超声时间的影响：称量1.000 0 g的黄瓜粉末5份，加入到装有冷凝回流装置的100 mL圆底烧瓶中，后加入60%的乙醇25 mL，设置超声时间为10、20、30、40和50 min，再放入70 ℃的超声波反应器中，结束后过滤、定容，分别测定黄瓜多酚提取率。

液料比的影响：称量1.000 0 g的黄瓜粉末5份，加入到装有冷凝回流装置的100 mL圆底烧瓶中，后依次加入15、20、25、30和35 mL浓度为60%的乙醇，然后放到70 ℃的超声波反应器中超声提取30 min后，过滤、定容，分别测定黄瓜多酚提取率。

乙醇含量的影响：称量1.000 0 g的黄瓜粉末5份，加入到装有冷凝回流装置的100 mL圆底烧瓶中，后依次加入25 mL浓度（φ，下同）为40%、50%、60%、70%和80%的乙醇，设置超声提取时间30 min，70 ℃超声后，过滤、定容，分别测定黄瓜多酚提取率。

超声温度的影响：称量1.000 0 g的黄瓜粉末5份，加入到装有冷凝回流装置的100 mL圆底烧瓶中，需要放到60、65、70、75和80 ℃的超声波反应器中超声提取，依次加入25 mL浓度为60%的乙醇，提取30 min后，过滤、定容，分别测定黄瓜多酚提取率。

1.3.2 响应面试验设计 根据所考察的单因素对多酚提取率的影响，在筛选出的最佳工艺条件基础上，为了获得最合适的提取工艺。选择4个单因素为自变量，以黄瓜多酚提取率为指标，利用Box-Behnken设计进行优化，因素和水平见表1。

1.3.3 黄瓜多酚对酪氨酸酶的抑制作用 用pH=6.85的磷酸盐缓冲液将黄瓜多酚和曲酸（对照）配置成不同浓度的溶液，备用。另用pH=6.85的磷酸盐缓冲液配制1.5 mmoL·L-1的L-酪氨酸溶液和100 U·mL-1的酪氨酸酶溶液，备用。分别按表2方案，配制以下4种溶液。

试验时，于10 mL的比色管中分别加入a、b、c、d 4组溶液，然后分别加入0.5 mL的L-酪氨酸溶液，于37 ℃保温反应14 min，并分别在15 min时测定溶液在475 nm处的吸光度Aa、Ab、Ac、Ad，则通过下式可计算得单次酪氨酸酶的抑制率，每个试验3次重复，计算均值，即酪氨酸酶的抑制率：

酪氨酸酶抑制率/%=[1-（Ac-Ad）/（Aa-Ab）]×100。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声时间对黄瓜多酚提取率的影响 从图1可以看出，多酚提取率呈现出随超声时间延长先上升后下降趋势，在超声水浴中提取30 min时达到最大值，且30、40、50 min多酚的提取率均显著高于10、20 min，而30、40、50 min之间多酚的提取率无显著差异。这是因为超声时间太短，黄瓜颗粒中的多酚还没有完全溶解到溶剂中;当超声时间超过30 min时，黄瓜颗粒中的多酚已基本溶出，但超声时间过长，部分多酚类物质中不稳定成分会发生降解，从而使得多酚提取率下降，因此最佳超声时间为30 min。

2.1.2 液料比对黄瓜多酚提取率的影响 由图2可以看出，多酚提取率呈现出随液料比升高先上升后下降趋势，在液料比为25 mL·g-1时达到最大值，且液料比为25、30 mL·g-1的多酚提取率均显著高于其他液料比，而25 mL·g-1和30 mL·g-1液料比之间多酚提取率无显著差异。这是因为料液比增大，溶剂量变得更大，促进了多酚的溶出，使得提取率增大，但液料比超过25 mL·g-1后，过多的溶剂，会导致过滤、浓缩等过程中多酚损失增大，从而使得多酚提取率下降。因此最佳液料比为25 mL·g-1。

2.1.3 乙醇含量对黄瓜多酚提取率的影响 由图3可以看出，多酚提取率呈现出随乙醇含量升高先上升后下降趋势，在乙醇含量为60%时达到最大值，且乙醇含量为60%、70%多酚提取率均显著高于其他乙醇含量，而60%和70%乙醇含量之间多酚提取率无显著差异。这是因为多酚在植物细胞中与蛋白质、多糖等以氢键等疏水键形式结合，要使多酚充分浸出，需破坏疏水键，当乙醇含量较低时，溶剂极性较高，较难破坏分子间的氢键，而乙醇含量过大时，黄瓜颗粒中醇溶性杂质会过多地溶出，并与多酚类物质竞争溶剂，多酚提取率较低。因此，最佳乙醇含量为60%。

2.1.4 超声温度对黄瓜多酚提取率的影响 由图4可以看出，多酚提取率呈现出随超声温度升高先上升后下降趋势，在超声温度为70 ℃时达到最大值，70 ℃多酚提取率显著高于其他处理。这是因为随着超声温度的升高，分子间的运动更加剧烈，使溶剂更容易进入细胞，有利于多酚的分离与溶出。但超声温度过高时，多酚中部分不稳定的结构会发生变化，使得多酚的提取率降低。因此，最佳超声温度为70 ℃。

2.2 响应面优化工艺

2.2.1 响应面设计及分析 以黄瓜多酚提取率为响应值，在单因素的基础上，对影响黄瓜多酚提取率的工艺因素进行响应面优化，并利用Design Expert 8.05b软件进行Box-Benhnken试验设计与分析，结果见表3。

由表3试验结果，通过Design Expert 8.05b软件分析，得到以黄瓜多酚提取率（Y）为响应值，用字母（A、B、C、D）分别替代超声时间、液料比、乙醇含量和超声温度为自变量的四元二次回归模型：

Y=11.21+0.020A+0.38B+0.39C-0.49D- 0.13AB-0.012AC-0.15AD+0.17BC+0.16BD- 0.15CD-0.15A2-0.46B2-0.73C2-0.69D2。

由表4可知，该回归模型F=51.75，P<0.000 1，表明这个模型已经达到极显著水平。相关系数R2=0.981 0，表明四元二次回归模型的预测值与试验值具有较高的相关性，超过98%的试验值可以利用该四元二次回归模型来进行预测与解释;失拟项F=3.82，P=0.104 4>0.05，由此可以看出该失拟项不显著;变异系数为1.35%<5%，表明该回归模型的重现性好，准确性和可信度高。根据F及P值分析可以得到各工艺条件对黄瓜多酚提取率影响的顺序为：超声温度>乙醇含量>液料比>超声时间。响應值与所考察的各工艺之间不是单纯的线性关系，其中对响应值影响极显著的有液料比一次项、乙醇含量一次项、超声温度一次项，超声时间的二次项、液料比的二次项、乙醇含量的二次项、超声温度的二次项;对响应值影响显著的有超声时间和超声温度的二次交互项、液料比和乙醇含量的二次交互项、液料比和超声温度的二次交互项、乙醇含量和超声温度的二次交互项，其他项对响应值影响不显著。

2.2.2 响应面分析 图5～10左边是黄瓜多酚提取率的响应面图，右边是黄瓜多酚提取率的等高线图。图中反映了试验设计中的4个单因素中有2个因素取零水平时，另2个因素的交互作用对提取黄瓜多酚的影响程度，从图中就可以清晰地看出曲线的陡度和等高线的形状得到所考察的变量之间的交互作用。从图中可以看出，响应面曲线最陡的是液料比和乙醇含量，其等高线偏离圆形也最大，由此可知，液料比和乙醇含量之间的交互作用的影响程度是最显著的;在响应面曲线陡度和等高线偏离圆形的程度大小中，也可以看出影响液料比和超声温度两者之间的交互作用次之，表明液料比和超声温度的交互作用对黄瓜多酚的影响程度次之，根据上述，可得到各因素交互作用对黄瓜多酚提取率影响的显著性顺序为BC>BD>AD>CD>AB>AC。

2.2.3 最佳工艺验证 通过分析软件对回归模型进行拟合分析，得到黄瓜多酚的最佳提取工艺为：超声时间30.13 min，液料比27.05 mL·g-1、乙醇含量63.51%、超声温度68.27 ℃，预测的多酚提取率的最大值为11.44 mg·g-1。为确定拟合的最佳提取工艺的准确性与可靠性，结合实际试验操作，将各工艺条件修正为：超声时间30 min，液料比27 mL·g-1、乙醇含量64%、超声温度68 ℃，进行3次平行验证性试验，黄瓜多酚提取率为11.33 mg·g-1，与模型试验的预测值11.44 mg·g-1相比，两者相对误差为0.96%，表明了该模型具有较好的拟合性。因此，利用响应面法对黄瓜多酚优化所得的提取工艺参数预测准确，数据可靠，具有一定的实用价值，为黄瓜多酚的提取与开发提供新的方向。

2.3 黄瓜多酚对酪氨酸酶的抑制作用

由图11可以看出，随着对照曲酸浓度的增加，曲酸对酪氨酸酶的抑制率迅速增加，在质量浓度为60 mg·L-1时，抑制率达80%以上;随着黄瓜多酚浓度的增加，黄瓜多酚对酪氨酸酶的抑制率逐渐提高，在质量浓度为200 mg·L-1时，抑制率达76.35%，表明黄瓜多酚对酪氨酸酶有一定的抑制作用，且多酚浓度与酪氨酸酶抑制率存在量效关系，但其对酪氨酸酶的抑制率小于曲酸。表明黄瓜多酚对酪氨酸酶具有一定的抑制作用，可作为天然的酪氨酸酶抑制剂，是一种潜在的天然美白添加剂。

3 讨论与结论

具有美白功效的护肤品受到了人们的喜爱，但其往往含有熊果苷、曲酸等化学合成的酪氨酸酶抑制剂，这些抑制剂的安全性已受到人们的广泛关注。一些研究结果表明，天然植物多酚具有一定的酪氨酸酶抑制作用，与化学合成酪氨酸酶抑制剂相比，天然植物多酚更加安全、温和与稳定。刘东茹等[10]比较了苹果幼果多酚及根皮苷对酪氨酸酶的抑制作用，结果表明，苹果多酚可通过抑制酪氨酸羟化生成多巴及抑制多巴氧化成多巴醌来减少黑色素的合成，苹果幼果多酚对酪氨酸酶活性的抑制效果优于根皮苷，有望开发应用于美白产品中。宋见喜等[11]对地榆多酚的纯化工艺进行研究，并进一步研究了地榆多酚对酪氨酸酶活性的抑制作用，结果表明，地榆多酚对酪氨酸酶具有较好且稳定的抑制效果，可以作为一种天然的抑制剂应用到美白护肤品中。黄瓜中含有多酚等天然有效成分，常被人们切片后直接敷于面部，具有美容、护扶、养颜和抗衰老等功效，与苹果幼果多酚对酪氨酸酶的抑制率（85.81%）相比，黄瓜多酚的抑制率仅为76.35%，但强于地榆多酚（最大仅为64.30%）。植物中有效成分的提取方法能直接影响到目标产物对酪氨酸酶的抑制活性，目前，从植物中提取多酚的常见方法有水提法、微波辅助法、超声波辅助法、酶解法和超临界法等[12]，其中，超声波属于机械振动波，其空化、剪切和机械效应能在不破坏多酚活性成分的前提下，将植物多酚有效地从细胞内部分离出来，具有提取时间短、耗能低、提取率高等优点[13]。笔者以黄瓜为原料，考察了各工艺因素对黄瓜多酚超声提取工艺的影响，并利用响应面法对提取工艺进行了优化，建立了四元二次回归方程：

Y=11.21+0.020A+0.38B+0.39C-0.49D- 0.13AB-0.012AC-0.15AD+0.17BC+0.16BD- 0.15CD-0.15A2-0.46B2-0.73C2-0.69D2，該回归模型准确性和可信度高，可用于黄瓜多酚提取分析与预测。黄瓜多酚提取的最佳工艺为：超声时间30 min、液料比27 mL·g-1、乙醇含量64%和超声温度68 ℃，黄瓜多酚提取率为11.33 mg·g-1，与模型预测值（11.44 mg·g-1）相比，其相对误差为0.96%，表明了该模型具有较好的拟合性。黄瓜多酚对酪氨酸酶有一定的抑制作用，且多酚浓度与酪氨酸酶抑制率存在量效关系，可作为天然的酪氨酸酶抑制剂，是一种潜在的天然美白添加剂，该工艺为黄瓜多酚的提取与开发提供新的方向。

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