结核分枝杆菌Rv2991、Rv3428c重组蛋白对菌阴肺结核的辅助诊断价值

胡建平 韩俊垒 边红芝

(河南省胸科医院呼吸内科，河南 郑州 450002)

在2019年的世界卫生组织的报告中，全球已有1 000万(900万～1 100万)人患有结核病，其中因病死亡率为132/10万，且以低收入及中等收入国家占比最多[1]。我国属于结核病高负担国家，近几年随着结核病防治工作的展开，国内活动性肺结核患病率虽有下降，但整体的患病情况依然并不乐观[2]。结核病的早期诊断与控制依然是国内工作重点。结核病防治的关键是早期和准确地确诊[3]。目前我国结核病诊断方法多参照世界卫生组织所推荐的细菌学诊断技术，即痰涂片与细菌培养[4]。但这两种诊断技术均易受痰样本质量与结核分枝杆菌菌体结构的影响，检测的灵敏度偏低，因此寻找灵敏度与特异度均更为理想的诊断方法极为必要[5]。目前血清学诊断多被用于多种疾病的早期诊断[6]，也已有研究初步探讨该检测方法针对结核病诊断的特异度与灵敏度[7]。菌阴肺结核是指1次痰培养、3次痰涂片结果均为阴性的肺结核，这类肺结核相对特殊，因诊断缺乏金标准，故早期非常容易误诊和漏诊，故对于这类患者可以考虑应用血清学方法诊断检出[8-9]。Rv2991、Rv3428c是新发现的结核分枝杆菌重组蛋白抗原，本研究旨在探讨结核分枝杆菌Rv2991、Rv3428c重组蛋白辅助诊断菌阴肺结核的价值，为菌阴肺结核的血清学诊断提供参考。现将结果报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2016年3月—2018年5月我院收治的初治菌阴肺结核患者100例(A组)，同期在我院接受治疗的其他肺部疾病患者100例(B组)及行常规全身体检健康者100例(C组)作为对照。3组研究对象年龄均≥18岁，A组均为菌阴肺结核患者，符合《肺结核诊断和治疗指南》[10]中菌阴肺结核诊断标准；B组经细菌学检查确诊为非结核病患者，但有咳痰、咯血等肺结核主要临床症状。A组男61例，女39例；年龄27～65岁，平均(40.21±10.11)岁；体质量44～77 kg，平均(60.21±10.20)kg；受教育程度：初中及以下37例，中专或者高中40例，大专及以上23例。B组男60例，女40例；年龄28～65岁，平均(41.41±10.39)岁；体质量45～75 kg，平均(59.12±9.20)kg；受教育程度：初中及以下40例，中专或高中38例，大专及以上22例。C组男65例，女35例；年龄26～65岁，平均(39.47±10.07)岁；体质量45～78 kg，平均(60.44±10.31)kg；受教育程度：初中及以下38例，中专或高中36例，大专及以上26例。3组性别、年龄、体质量、受教育程度等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，全部纳入者对研究内容均知情，并签署知情同意书。排除标准：合并恶性肿瘤疾病者，心、肝、肾等重要脏器功能不全者，意识障碍或精神疾病等无法很好地配合研究者，合并血液系统疾病者，合并免疫疾病者，参加本次研究的同时还参加其他相关研究者。

1.2 主要仪器与试剂

质粒pET-28a、大肠杆菌DH5a、BL21(DE3)感受态细胞系本室保存，其感受态细胞由本课题组制备。Rv2991、Rv3428c蛋白全基因及引物由华大基因公司合成。DG3022A酶标仪、洗板机购买于美国BIO-RAD公司，ND-1000型蛋白测量仪购买于美国Nano Drop公司。内切酶及其他酶类购买于大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司。PCR产物纯化试剂盒、小量质粒提取试剂盒、微量蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG、显色液等购买于北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1引物设计与目的基因扩增 上下游引物设计：上游引入酶切位点，下游将终止子去掉并引入酶切位点。然后以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA作为模板，在DNA扩增仪上进行基因扩增，条件：94 ℃预变性5 min后；94 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；最后72 ℃延伸5 min终止反应，使用PCR试剂盒回收目的基因。

1.3.2表达工程菌pET28a-Rv2991以及pET28a-Rv3428c的构建 对目的基因及载体质粒进行双酶切，回收产物后加入连接酶过夜。取连接产物转接至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在38 ℃的条件下培养过夜；将过夜后长出的细菌菌落接种至液体培养基中，摇晃提取质粒，使用内切酶行双酶切鉴定，鉴定成功后送至实验室完成测序验证，获得表达工程菌pET28a-Rv2991和pET28a-Rv3428c。

1.3.3Rv2991、Rv3428c重组蛋白的原核诱导表达以及纯化 将表达工程菌pET28a-Rv2991以及pET28a-Rv3428c转接至含有50 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃恒温震荡培养，诱导表达约8 h，离心收集菌体，并进行超声破碎。提取总蛋白后，进行 SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的表达形式。采用美国GE公司的AKTA纯化流程进行纯化，蛋白纯化后使用微量BCA蛋白定量试剂盒检测各Rv2991、Rv3428c重组蛋白的表达水平。操作严格参照试剂盒说明书进行。

1.3.4酶联免疫吸附(ELISA)法测定受试者血清吸光度值 采集受试者入组次日清晨空腹静脉血5 mL，1 h内3 300 r/min离心10 min分离血清，立即分装并于-70 ℃冰箱保存，所有样本无反复冻融，并在3个月以内完成检测。使用棋盘滴定法检测Rv2991、Rv3428c重组蛋白血清最佳稀释度与最佳包被浓度，使用酶标仪读取450 mm波长处的各血清样本的吸光度值。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 3组受试者血清中Rv2991、Rv3428c重组蛋白表达水平比较

3组受试者的血清中结核分枝杆菌Rv2991、Rv3428c重组蛋白表达水平比较差异具有显著意义(F=649.451～2 156.945，P<0.05)，其中A组患者血清中结核分枝杆菌Rv2991、Rv3428c重组蛋白表达水平高于B、C组(q=43.381～81.529，P<0.05)，B组与C组比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。

表1 3组受试者血清结核分枝杆菌Rv2991、Rv3428c重组蛋白表达水平比较

2.2 Rv2991、Rv3428c重组蛋白用于菌阴肺结核辅助诊断的效能

将B组作为对照，绘制ROC曲线，血清当中的Rv2991、Rv3428c重组蛋白辅助诊断菌阴肺结核的曲线下面积分别为0.834(95%CI=0.778～0.895)、0.829(95%CI=0.771～0.884)，同时cut-off值分别为58 000.50和48 500.50，并且在该值之下，血清中Rv2991、Rv3428c重组蛋白辅助诊断菌阴性肺结核的灵敏度分别为92.3%和81.5%，特异度则分别为85.5%和82.0%。见图1a、b。

3 讨 论

目前，我国结核病以患病率高、感染率高、不同地区间患病率差异大为主要特点[11]，在全部结核病患者中，菌阴肺结核发病率、误诊漏诊率、病死率均较高[12]。菌阴肺结核是指痰涂片抗酸杆菌及痰培养分枝杆菌结果均为阴性的结核病，属于活动性肺结核，在全部肺结核患者中占比超60%[13-14]。结核病前期多经细菌学检测来确定传染源[15]，同时细菌学检测也是结核病治疗的主要的依据[16]。然而细菌学检测易受诸多因素影响，早期诊断的特异度与灵敏度相对较低[17]。目前，诸多检查手段的出现与使用使得菌阴肺结核的前期诊断有所提高，尤其是血清免疫学与分子基因学等诸多检测手段的使用，为菌阴肺结核的早期诊断带来突破[18]。

a：Rv2991重组蛋白，b：Rv3428c重组蛋白

本研究分析Rv2991与Rv3428重组蛋白在菌阴肺结核中的表达，并将其用于菌阴肺结核患者的辅助诊断，旨在观察两者用于菌阴肺结核诊断的价值。结核分枝杆菌Rv2991与Rv3428重组蛋白均是结核分枝杆菌特异性抗原，能够引起机体的细胞与体液免疫，是机体重要的免疫原[19-20]。但因两者均是最近才发现的免疫原，故将其用于菌阴肺结核诊断是否有一定价值尚无相关报道。既往的研究报道证实，结核分枝杆菌特异抗原可用于结核病的血清学辅助诊断，且诊断的特异度及灵敏度均较高，是迄今可以作为单项检查用于结核病诊断的最佳抗原之一，也是目前商品化试剂盒中被广泛使用的一种抗原[21-23]。Rv2991与Rv3428c均是经仿生亲和、免疫层析、蛋白分离纯化、蛋白免疫原性生物信息学分析及表位预测等技术筛选出的新的且在临床检验中具有实际应用价值的重要免疫标志物[24]。前者是以pET28a作为载体，与相关的抗原构建充足质粒，并转化至菌株内，利用原核表达，对目的蛋白进行纯化，成功获得诱导的纯化表达抗原[25]。本研究结果显示，Rv2991、Rv3428抗原作为一种重组蛋白，在A组表达最高，其次为B组，C组表达最低；进一步绘制ROC曲线，以B组作为对照，验证其用于菌阴肺结核辅助诊断的效能，结果显示Rv2991重组蛋白诊断菌阴肺结核的曲线下面积为0.834，cut-off值为58 000.50，在该吸光度58 000.50值下，Rv2991重组蛋白辅助诊断菌阴性肺结核的灵敏度和特异度分别为92.3%和85.5%，曲线下面积值与诊断灵敏度、特异度均较高，有着较高的诊断价值。Rv3245c是RD11区典型基因，近几年该区抗原在肺结核疫苗研制方面的价值有一定报道[26]，RD11区Rv3245与Rv3428c编码的重组蛋白均能够引起小鼠γ-干扰素水平表达升高，表明Rv3428c抗原在结核病的诊断中也具有一定研究价值，可以作为融合抗原用于肺结核疫苗的研制[27-30]。本研究结果显示，3组受试者中A组血清中Rv3428c表达水平最高，其次为B组，C组水平表达最低；进一步绘制ROC曲线，以B组作为对照，验证其用于菌阴肺结核辅助诊断的效能，结果显示Rv3428c重组蛋白辅助诊断菌阴肺结核的曲线下面积为0.829，cut-off值为48 500.50，在该cut-off值下，Rv3428c重组蛋白辅助诊断菌阴性肺结核的灵敏度和特异度分别为81.5%和82.0%，曲线下面积与特异度均处于较高水平，提示Rv3428c辅助诊断菌阴肺结核有着较高的应用价值。但是目前国内外关于结核分枝杆菌Rv2991、Rv3428c重组蛋白用于辅助诊断菌阴肺结核的研究报道较少，故本研究结论尚没有循证医学相关的证据支持，还应在未来开展大样本、长时间的研究中加以验证。

综上所述，结核分枝杆菌Rv2991、Rv3428c重组蛋白用于菌阴肺结核的辅助诊断有着较高的特异度与灵敏度，具有一定的临床应用的价值。