美极梅奇酵母与酿酒酵母混合发酵对火龙果酒品质特性的影响

刘晓柱，赵湖冰，黎华，李银凤，于志海，刘晓辉，HARDIE William James，2，黄名正*

（1.贵州理工学院，贵州 贵阳 550003；2.常州大学，江苏 常州 213000）

酿造酒由原料经发酵后获得的酒精饮料，原料转化为乙醇主要由酵母菌进行生物转化。根据酵母菌发酵特性将其分成酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Sc）和非酿酒酵母（Non-Saccharomyces cerevisiae，NSc）两大类[1]。Sc主要进行酒精发酵，将原料中的糖转化为乙醇、二氧化碳和其它副产物[2]。利用Sc进行纯种发酵，操作简单、易于控制，但发酵酒中风味物质种类及含量均有限，酒质风味较为单一。近年来利用NSc与Sc进行混合发酵改善果酒的风味，已成为研究的一个热点。NSc可产生多种酯类、醇类、甘油以及多种酸类等风味物质，在很大程度上影响果酒的色泽、风味以及复杂度，对果酒的感官品评具有重要的影响[3-5]。

美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima，Mp）是一种常见的NSc，天然存在于各种水果、蜜腺、花朵等植物结构上[6]。在葡萄汁的酒精发酵前期，通常情况下可以检测到Mp的存在。Clemente-Jimenez等研究发现，在Mp与Sc共培养时，二者具有协同作用，有助于包括脂肪酸、酯和萜烯醇等多种芳香化合物的产生[7]。研究还发现，某些Mp菌株能够表达高水平的β-葡萄糖苷酶，并作用于多种含糖苷键的风味前体物质，有助于如萜烯类风味物质的释放，增强酒体风味特性[8]。此外，Mp与Sc混合发酵还能够降低发酵酒中的乙醇含量，同时增加酒体复杂度，可用于低度酒的发酵生产[9]。但Mp与Sc混合发酵对火龙果酒特性的影响还未见有相关报道。

火龙果是一种广泛分布于我国南方地区的水果品种，包括红皮白肉、红皮红肉和黄皮白肉3种，富含多种营养物质[10]。贵州省2001年开始引种试种，作为全省农村产业革命重点发展的水果之一，截至2018年，全省火龙果总产量为4.6万吨，产值达4.1亿元。罗甸火龙果和关岭火龙果也已成为国家地理标志产品，受到国家层次的保护。由火龙果发酵生产的火龙果酒，香气独特，口感较佳，且兼具保健功能，深受消费者的喜爱[11]。但目前火龙果酒发酵菌株通常采用葡萄酒活性干酵母，菌株品种有限，发酵酒体单一，同质化较为严重。采用非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵，可较好的解决这一问题。因此，本研究采用非酿酒酵母Mp与Sc共接种，进行混合发酵，分析其对火龙果酒品质特性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜红心火龙果：贵州省安顺市关岭县；赖氨酸固体培养基、WL营养琼脂鉴定培养基（Wallerstein laboratory nutrient agar）：贵州博奥瑞杰生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯；Mp：中国工业微生物菌种保藏管理中心；Sc ZYMAFLORE X16（简称X16）：法国LAFFORT公司。

1.2 仪器与设备

UH5300紫外分光光度计：日本日立公司；雷磁PHSJ-3F pH仪：上海仪电科学仪器股份有限公司；SA408B电子舌味觉系统：日本Insent公司；TQ8040NX气相质谱联用仪（GC-MS）：日本岛津仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培养

酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone eextrose medium，YEPD）（酵母浸粉 10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L）活化-80℃保存的Mp、Sc菌株。挑取Mp、Sc单克隆分别接种于YEPD液体培养基中，28℃，180 r/min培养24 h，备用。

1.3.2 发酵条件

取新鲜火龙果，去皮，打浆，调整糖度为24°Brix，pH值为3.5，加入40 mg/L二氧化硫、200 mg/L果胶酶，过夜处理。分装处理后的火龙果浆至2 L无菌三角瓶中，装量为70%。将培养好的Mp、Sc接种至火龙果浆中，使其Mp终浓度为107cfu/mL，Sc终浓度为106cfu/mL。接种方式为Mp+Sc组共同接种Mp和Sc菌株，Sc组单独接种Sc菌株。接种后，插上呼吸器，密封，室温（24℃）放置12 h。待发酵启动后，转移至18℃冷库中，静置发酵 16 d。分别在发酵的第 0、2、4、8、12、16 天取样，（1）称重，计算 CO2释放率；（2）测定 pH 值；（3）经适当浓度梯度稀释后，分别涂布在赖氨酸培养基和上，培养48 h计数，从而分析Mp、Sc菌株细胞个数。发酵结束后，离心，取上清液，分别用于常规理化指标、电子舌和气相质谱联用仪（gas phase mass spectrometer，GC-MS）检测。

1.3.3 测定条件

1.3.3.1 火龙果酒常规理化指标测定

参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定火龙果酒中乙醇体积分数、pH值、总酸、总糖。

1.3.3.2 火龙果酒感官特性测定

取80 mL火龙果酒样品至电子舌检测烧杯中。按照仪器说明书步骤，进行火龙果酒感官特性的检测。采样时间120 s，采样速度为1次/s，每个样品平行测定3次。

1.3.3.3 火龙果酒挥发性香气特性测定

采用顶空固相微萃取（solidphase microextraction，SPME）技术提取火龙果酒香气成分，参考李凯等方法对火龙果酒挥发性香气物质进行分析[11]。以环己酮为内标，采用内标法进行物质的定量分析。

1.3.4 数据整理与统计分析

采用Microsoft Excel 2010整理试验数据，并以平均值±标准差形式表示。采用SPSS 21.0软件进行数据显著性分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 火龙果特性

酿造原料红心火龙果采摘于2018年9月贵州省安顺市关岭县，颜色粉红色，糖度为（9.1±0.01）°Brix，pH 值为 3.41±0.01（图 1）。

图1 本研究所用红心火龙果Fig.1 Red pitaya used in this study

2.2 菌株生长特性

Mp和Sc以共接种的形式进行混合发酵火龙果酒，各菌群变化趋势如图2所示。

在发酵前4 d，非酿酒酵母Mp在总的酵母菌群中占较大的百分比，但其比例在不断降低，在发酵第8天基本上检测不到Mp菌群，发酵液中主要为Sc，一直维持到发酵结束。而酿酒酵母Sc随着发酵的不断进行，其菌群数量在不断增多，在发酵的第4天，在发酵液中所占比例超过Mp，并继续增加，在发酵第8天基本上很难检测到Mp菌群。

图2 共接种发酵火龙果酒酵母菌群动态变化Fig.2 Dynamic changes of yeast population in pitaya wine fermentation with co-inoculation

2.3 pH值、CO2释放率动态变化

龙果酒发酵过程中pH值和CO2释放率动态变化见图3。

图3 火龙果酒发酵过程中pH值和CO2释放率动态变化Fig.3 Dynamic changes of pH and CO2emission rate using Sc or Mp+Sc

在火龙果酒发酵过程中，CO2释放率逐渐增大，且混菌发酵组（Mp+Sc）CO2释放率要高于Sc组，在发酵的第4天达到最大值。接着逐渐降低，在第8、12、16天，两组CO2释放率基本一致（图3A）。

随着火龙果酒的发酵，发酵液pH值在发酵前期（前 4 d）逐渐降低，发酵中后期（4 d～16 d）又增加，表现出先降低后增加的趋势。但变化幅度不大。发酵初始pH值为5.0，在第4天，Sc发酵液pH值为3.3，Mp+Sc发酵液pH值为3.4。发酵结束的第16天，两组发酵液pH值均又增大到3.5（图3B）。

2.4 混合发酵火龙果酒基本理化指标

Mp与Sc混合发酵火龙果酒基本理化指标如表1所示。

表1 火龙果酒理化指标Table 1 Physical and chemical indicators of pitaya wine

与商业化酿酒酵母Sc组相比，混合发酵火龙果酒的乙醇体积分数、pH值、总糖3个指标与Sc组发酵火龙果酒没有区别。但混合发酵火龙果酒挥发酸显著低于纯种Sc发酵火龙果酒。

2.5 混合发酵火龙果酒感官特性

采用电子舌传感器，从酸味、苦味、涩味、后味、鲜味、咸味等方面分析Mp与Sc混合发酵对火龙果感官特性的影响。火龙果酒滋味属性雷达图见图4。

图4 火龙果酒滋味属性雷达图Fig.4 Pitaya wine taste attribute radar chart

结果如图4所示，混合发酵火龙果酒酸味测定值显著小于Sc纯种发酵火龙果酒（P<0.05）。其它感官数值Mp+Sc组与Sc组之间无显著区别。

2.6 混合发酵火龙果酒香气特性

采用顶空固相微萃取-气质联用方法分析Mp与Sc混合发酵对火龙果香气特性的影响。火龙果酒中挥发性物质种类及含量见表2。

结果如表2所示，Mp+Sc混合发酵火龙果酒中共检测出46种挥发性物质成份，包括酸类物质3种、醇类物质16种、酯类物质18种、醛酮类物质3种、烃类物质2种、其它类物质4种；Sc纯种发酵火龙果酒中仅检测到39种挥发性物质，包括酸类物质3种、醇类物质13种、酯类物质16种、醛酮类物质2种、烃类物质2种、其它类物质3种。其中在醇类物质、酯类物质、醛酮类物质、其它类物质方面Mp+Sc混合发酵均增加了物质的种类。

表2 火龙果酒中挥发性物质种类及含量Table 2 The aroma substances and their contents in pitaya wine

续表2 火龙果酒中挥发性物质种类及含量Continue table 2 The aroma substances and their contents in pitaya wine

尽管Mp+Sc混合发酵火龙果酒中酸类物质和烃类物质的种类均比Sc组增加，但这些类物质总量却未增加。Mp+Sc组、Sc组酸类物质总量分别为（2.84±0.14）、（2.42±0.23）mg/L，烃类物质总量分别为（0.51±0.04）、（0.34±0.03）mg/L。另外，Mp+Sc混合发酵火龙果酒中既增加了酯类物质、醛酮类物质、其它类物质的种类和含量。

醇类是酒类中含量较高的一类化合物，主要呈现出清香和清鲜香气。混合发酵增加了醇类物质种类，Mp+Sc发酵火龙果酒中检测到16种醇类物质，比Sc单独发酵多3种。但混合发酵并未增加醇类物质总量，相反醇类物质总量低于Sc纯种发酵火龙果酒，两种发酵火龙果酒中醇类物质总量分别为（27.61±1.31）mg/L和（30.46±1.72）mg/L（图 5）。

图5 火龙果酒中挥发性物质含量Fig.5 Contents of aroma substances in pitaya wine

高级醇，又称杂醇油，是碳原子数大于2的脂肪族醇类的统称。分析发现，Mp+Sc混合发酵火龙果酒中高级醇的含量也较Sc发酵火龙果酒中低。

酯类物质是各种酒中主要呈香物质之一，阈值一般较低，常具有各种花香和水果香。在2种火龙果发酵果酒中主要的酯类物质均为辛酸乙酯、己酸乙酯和葵酸乙酯，在Mp+Sc混合发酵火龙果酒中其占酯类物质比例分别为49.36%、20.02%、19.35%，在Sc纯种发酵火龙果酒中其占酯类物质比例分别为51.40%、23.09%、16.59%。辛酸异戊酯、δ-己醇内酯和N-甲氧羰基-L-脯氨酸十八烷基酯是Mp+Sc混合发酵火龙果酒中特有酯类物质；3-甲基-2-丁烯-1-基-丁酸酯是Sc纯种发酵火龙果酒中特有酯类物质。混合发酵火龙果酒中酯类物质总量高于Sc纯种发酵火龙果酒中含量。

风味活性值（odour activity value，OAV）为香气物质浓度与该物质阈值的比值，用来评价食品中香气物质的贡献度。一般OAV>1，认为该物质对香气成分有着突出的贡献度。反之，OAV<1，认为该物质对香气成分贡献度不大。分析了2种发酵火龙果酒中19种主要的挥发性香气物质OAV值，见表4。

表4 火龙果酒中主要香气物质OAVTable 4 The OAV of main aroma substances in pitaya wine

发现OAV>1的物质有13种，OAV<1的有6种。在Mp+Sc混合发酵火龙果酒中OAV>1的有12种，OAV值最大的是辛酸乙酯，为4 080.81，OAV<1有7种，OAV值最小的为丁二酸二乙酯，为0.01。

3 讨论与结论

由于NSc最初是在变质的葡萄酒中分离出来的，因此，传统观点认为其为葡萄酒酿造中的腐败菌群，一直未受到重视。但越来越多的研究表明，NSc在葡萄酒、多种果酒的酒体形成过程中发挥积极作用，有助于增加酒体的丰富性和感官特性[12]。因此，近年来对NSc生物多样性、酿酒特性及相关应用研究成为国内外的研究热点之一。其研究领域也由葡萄酒领域拓展到多种果酒领域，如刺梨果酒[13]、野樱莓果酒[14]、柿子果酒[15]、蜜桔果酒[16]等。但NSc对火龙果酒品质的影响还未知。本研究以Mp与Sc共接种的方式进行了火龙果酒的发酵，以Sc纯种发酵为对照，结果表明，Mp与Sc混合发酵降低了火龙果酒中挥发酸的含量，增加了挥发性物质的种类和含量，如酯类、醛酮类、烃类等，使得酒体丰富度更加复杂。

研究表明，Mp中的某些菌株可分泌多种酶类，如果胶酶、蛋白酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、亚硫酸盐还原酶、木聚糖酶、脂肪酶等，其中一些酶作用于相关底物，有助于风味物质的释放[6，17-18]。本研究发现，采用Mp与Sc混合发酵增加了多种酯类物质的种类和含量，以及多种醇类物质的种类。这可能与Mp分泌的一些酶类相关，因此，在后续的研究中，将深入分析所用Mp菌株酶学特性，剖析挥发性香气物质产生机理。

本研究还进一步分析了混合发酵过程中Mp菌群动态变化，发现随着发酵的不断进行，Mp在发酵菌群中所占比例逐渐降低，在发酵第4天所占比例低于50%，在发酵的第8天开始，发酵液中很难检测到Mp菌群了。通常情况下，Mp对酒精较为敏感，对酒精的耐受性较差，随着酒精发酵的不断进行，逐渐死亡，故Mp主要在酒精发酵的前期发挥作用，产生多种挥发性物质，丰富酒体。因此，研究报道，采用Mp与Sc混合发酵有助于降低发酵酒的乙醇含量，可用于低度果酒的生产[19]。但本研究中，混合发酵火龙果酒乙醇含量与Sc纯种发酵火龙果酒相比，未见有显著区别，可能与菌株本身特性，或者接种方式有关。

此外，Mp还可产生抗菌物质普切明（pulcherrimin），通过竞争性吸收环境中的铁离子，抑制其它微生物对铁离子的需求，可作为一种光谱性抗菌剂[20-22]。因此，在果酒生产中，采用Mp作为生产菌种，通过生物防控，可有效抑制野生杂菌，减少二氧化硫的使用量。

综上，本研究首次分析了Mp与Sc混合发酵对火龙果酒特性的影响。结果表明，Mp与Sc混合发酵可有效降低火龙果酒中挥发酸含量，增加酒体中酯类、醇类、醛酮类、烃类等挥发性物质的种类，降低了酸类、醇类物质的含量。此外，Mp与Sc混合发酵还降低了酸味感官特性。因此，Mp与Sc混合发酵是一种可以推荐的火龙果酒的生产方式，既增加了酒体的复杂度，又降低了同质化现象。但本研究仅分析了Mp与Sc混合发酵的一种接种方式，一种接种比例，更多的发酵方式还需要分析比较，从而确定较优的生产方式。