石榴皮总黄酮超临界萃取及萃余物黄色素提取

尹春光，宋文路，李明丽，刘亚文，2，王晓强，王森

（1.济宁学院生命科学与工程系，山东 曲阜 273155；2.华南农业大学食品学院，广东 广州 510640）

石榴皮富含黄酮、多酚、萜类等活性物质，有抗氧化、抗流感病毒、抗菌、抗癌、保护心脑血管、调节内分泌等多种作用，具有较大的药用价值[1-2]。石榴皮约占石榴重量的1/5，研究表明石榴皮中的主要化学成分是黄酮类物质[3-4]。植物黄酮的提取来自根、茎、叶、果实、果皮，石榴皮黄酮的提取纯化常见方法有浸提、超声波辅助、微波辅助、酶法等[5-8]。总三萜的提取在药用植物中研究较多，常使用微波辅助提取、超声波辅助萃取、超临界萃取等方法[9]，石榴皮中未见三萜类提取研究。

石榴果皮含有天然黄色素，关于石榴皮黄色素近些年研究集中在其稳定性，提取纯化等有少量报道。超临界CO2技术可使活性成分与浸提溶剂充分结合，有利于活性成分的溶出与释放，从而提高提取率，可用于黄酮、多酚、萜类物质的提取分离[10]，但是萃取残渣的活性物质如何进一步提取少有研究，超临界CO2技术同步提取石榴皮黄酮、三萜及萃取残渣中黄色素提取尚未见报道。近几年，使用同一工艺流程同步提取植物中多种活性物质开始受到关注，例如使用溶剂浸提法同步提取山楂皮[11]、石榴花总黄酮、总多酚和三萜类物质[12]，可有效提高生产产出及效益。

山东鲁西南地域石榴品种丰富、产量大，为实现对石榴皮的高效利用，本研究以地方资源石榴的剩余物石榴皮为研究对象，根据物质溶解性、极性的差异，利用超临界萃取法充分萃取总黄酮、三萜类物质。同时发现在筛选到的超临界萃取条件下黄酮类提取率高，黄色素萃取极微，进一步利用超声波辅助提取萃余物（超临界萃取残渣）中活性物质黄色素，并实现石榴皮的高值化利用，本研究首次利用超临界萃取法同步获取石榴皮中总黄酮、三萜类，并获取浓缩在残渣中的黄色素。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石榴：鲁西南地区晚秋市售，石榴皮经50℃干燥，粉碎机粉碎，过100目筛；标准品芦丁、熊果酸（分析纯）：生工生物工程（上海）有限公司；乙醇、乙醚：天津市凯通化学试剂有限公司；NaNO2（5%）、Al（NO3）3（10%）、NaCO3（10%）、NaOH（1 mol/L）：国药集团化学试剂有限公司；香草醛：江苏采薇生物科技有限公司；高氯酸、冰醋酸：莱阳经济技术开发区精细化工；所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

超临界 CO2萃取仪（SPE-ED SAFE BASIC）：美国APPLIED SEPARATIONS（ASI）公司；紫外分光光度计（T6）：北京普析通用仪器有限公司；电子分析天平（ME54）：上海恒平科技有限公司；医用数控超声波清洗器（KQ-250DE）：昆山市超声仪器有限公司；数显恒温水浴锅（HH-4）：邦西仪器科技有限公司；中药粉碎机（FW135）：天津市泰斯特仪器有限公司；真空浓缩离心仪（SCIENTZ-1LS）：宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 总黄酮、三萜类超临界萃取

取石榴皮粉末10 g加入超临界萃取仪，0.5 mL乙醇作为夹带剂，设定压力、温度、时间条件，以2 mL/min收集[10]，留萃余物备用。加入10 mL乙醇溶解，测定总黄酮、三萜类提取率。

1.3.2 萃余物提取黄色素

将萃余物放入锥形瓶中，按照料液比1∶5（g/mL）加入20%乙醇，在恒温水浴锅中50℃浸提1 h，经超声波（频率100 kHz）处理20 min或微波（350 W）处理70 s，静置弃去下层沉淀，以4 000 r/min离心上清液10 min，得到含有黄色素的乙醇提取液[13-14]。

移液器取超声波[15-16]或微波处理[17]的2种提取液2 mL，过AB-8大孔树脂柱，蒸馏水清洗树脂柱后用20%乙醇洗柱，洗脱速率0.8倍柱体积/h、吸附时间3 h、洗脱体积为3倍柱体积，得到黄色素提取液，减压抽滤浓缩至原体积1/5，在0.08 MPa下，35℃减压干燥8 h，得黄色素粉末。

1.3.3 总黄酮、三萜类及黄色素提取率测定

总黄酮的测定根据文献[1，18]稍作修改。准确称取芦丁标准品0.5 g，乙醇（65%）定容至50 mL，取5 mL定容至100 mL作为标准溶液（0.5 mg/mL）。取不同体积溶液至10 mL容量瓶，各加入0.5 mL NaNO2（5%），混匀静置反应6 min后，加入0.5 mL Al（NO3）3（10%），混匀再静置反应 6 min，加入 4 mL NaOH（1 mol/L），65%乙醇定容至10 mL，混匀静置至少15 min后510 nm处测定吸光度，以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，线性回归方程：y=0.010 6x+0.008 6，R2=0.999 7。取样品提取液，测量吸光度，根据回归方程及样品稀释倍数计算总黄酮提取率。

三萜类测定根据文献[9，19]稍作修改，准确称取熊果苷0.5 g，无水乙醇溶解至50 mL定容，取2 mL定容至100 mL作为标准溶液（0.2 mg/mL）。取不同体积溶液至试管中，提取液挥干，加入0.2 mL香草醛乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，60℃水浴15 min，加入4 mL冰醋酸定容至10 mL，混匀后静置10 min在548 nm下测定吸光度。以熊果苷质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，线性回归方程：y=0.010 7x-0.032 8，R2=0.999 6。取样品提取液，测量吸光度，根据回归方程及样品稀释倍数计算三萜类提取率。

黄色素测定参照文献[13-14]稍作修改，石榴皮粉末 10 g，按照料液比 1∶5（g/mL）加入 20%乙醇，在恒温水浴锅中 50℃浸提 1 h，超声（100 kHz）20 min，静置弃去下层沉淀，以4 000 r/min离心上清液10 min，得到含有黄色素的乙醇提取液，根据1.3.1经超临界萃取后去萃取残渣（萃余物）抽滤浓缩洗柱，分光光度计扫描测定黄色素最大吸收波长。取0.5 g真空浓缩粉末，20%乙醇溶解定容至50 mL，取1 mL定容至100 mL，作为标准溶液（0.1 mg/mL）配制成不同浓度标准液[13]。分光光度计进行扫描确定最大吸收波长，扫描确定最大吸收波长为372 nm，检测波长与朱庆书等的结果一致[14]。在该波长下测吸光度，以黄色素质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，线性回归方程：y=0.0102x+0.003 4，R2=0.999 5。取样品提取液，测量吸光度，根据回归方程及样品稀释倍数计算黄色素提取率。

式中：n为总黄酮、三萜类、黄色素质量，mg；m为石榴粉末质量，mg。

1.3.4 抗氧化活性

1.3.4.1 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）自由基清除能力测定

DPPH自由基清除能力测定参照文献[20-21]。取最优条件下获取的超临界萃取液0.5 mL，加入DPPH甲醇溶液，定容，以总黄酮提取率为依据换算，根据1.3.2取最优条件下获得的黄色素粉末，精确称取1 mg，经甲醇溶解，定容，换算为10 μg/mL样品溶液备用。将上述两种样品液与DPPH甲醇液以1∶4体积比混合，充分混匀，避光室温（25℃）静置后分光光度计517 nm测定。提取液中活性物质质量换算公式：m=（V/M）×N×A（式中：m为活性物质质量，mg；V为萃取液体积，mL；M为石榴皮粉末质量，mg；N为萃取物稀释倍数；A为活性物质提取率，%）。以阿魏酸（ferulic acid，FERA）浓度（μmol/L）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程：y=0.937 5x+29.081（R2=0.995 4）。以 DPPH溶液自身吸光值（ADPPH）与样品溶液吸光值（A样品）之差与DPPH溶液自身吸光值比值表示，DPPH自由基清除率/%=[（ADPPH-A样品）/ADPPH]×100。FERA微摩尔数相当于每克样品中DPPH自由基清除能力（μmol FERA/g）。

1.3.4.2 2，2'-二氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）[（2，2'-azino-di-（3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonicacid），ABTS+）自由基清除能力测定

ABTS+自由基清除能力测定参照文献[20-21]，根据1.3.4.1样品处理方法，准备总黄酮样品液和黄色素样品液。取K2S2O8与ABTS以体积比1∶1混合，4℃过夜经充分混合得工作液。分别取2种样品液各0.1 mL，加入工作液，室温（25℃）放置5 min，734 nm波长下测吸光度。以Trolox浓度（μmol/L）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程：y=5.199x+4.005 6，R2=0.9986。以ABTS溶液自身吸光值（AABTS）与样品溶液吸光值（A样品）之差与ABTS溶液自身吸光值比值表示，ABTS+·清除率/%=[（AABTS-A样品）/AABTS]×100。Trolox微摩尔数为每克样品中ABTS+·清除能力（μmol Trolox/g）。

1.4 工艺条件确定

1.4.1 单因素试验

采用1.3.1及1.3.2的方法提取总黄酮、三萜类及黄色素，考察萃取条件对总黄酮、三萜类的影响，由于黄色素的提取是利用萃余物（超临界萃取后的残渣）经超声波辅助提取，由超临界萃取条件变化决定萃余物提取率，因此将黄色素提取率与总黄酮、三萜类提取率一起考察，考察超临界萃取条件（时间、浓度、压力、温度）对超临界萃取总黄酮、三萜类提取率及萃余物黄色素提取率影响。参考文献设定参数[10，19，22]，提取条件为：萃取时间设置为 50、70、90、120、150 min 进行试验，35 MPa，75℃，加入0.5 mL 75%乙醇溶液作夹带剂，考察时间对提取率的影响；固定时间90 min，将乙醇浓度设置为75%、80%、85%、90%、95%，35MPa，75℃，进行试验，考察浓度对提取率影响；固定时间90 min，乙醇浓度90%，温度75℃，将压力设置为20、25、30、35、40MPa，考察压力对提取率的影响；固定时间90min，乙醇浓度90%，压力30 MPa，将温度设置为65、70、75、80、85℃，考察温度对提取率影响。

1.4.2 萃余物中黄色素提取方法

根据1.3.2使用超声波、微波辅助提取萃余物中黄色素，以确定本研究超临界萃取与超声波结合、超临界萃取与微波处理结合的最优组合提取萃余物中黄色素。

1.4.3 正交试验

基于1.4.1试验结果，以提取条件为变量，以总黄酮、三萜类及黄色素提取率为指标，选择最优组合，L9（34）正交表见表1。

表1 正交试验设计Table 1 Design of orthogonal

1.5 数据分析

数据分析使用SPSS statistics 19软件，结合Excel 2013和GraphPad Prism 7绘图，正交设计助手II进一步验证正交试验结果。单因素试验及验证试验数据（平均值±标准偏差）经3次重复试验获得，SPSS进行方差分析，Duncan′s差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 时间对总黄酮、三萜类及萃余物黄色素提取率影响

时间对总黄酮、三萜类及萃余物黄色素提取率影响见图1。

图1 时间对总黄酮、三萜类提取率及萃余物超声处理黄色素提取得率的影响Fig.1 Effect of time on extraction rate of total flavonoid，triterpenoids and yellow pigment

随萃取时间变化，总黄酮、三萜类提取率呈先上升后降低曲线变化，总黄酮、三萜类90 min时提取率达到最大，分别是（5.794±0.001 15）%，（0.434±0.001 73）%。研究表明萃取时间会影响部分黄酮、三萜类结构，影响活性物质提取[22-23]。检测发现本条件下超临界萃取黄色素萃取极微，将萃余物进行超声波处理并提取到较为丰富的黄色素。在经超临界萃取90 min后，超声波处理萃余物，黄色素提取率达到（5.885±0.002 40）%。利用Duncan法分析，不同时间的总黄酮、三萜类提取率差异显著（P<0.05），此时萃余物经超声波处理的黄色素提取率也差异显著（P<0.05），因此选取90 min为最适萃取时间。

2.1.2 浓度对总黄酮、三萜类及萃余物黄色素提取率影响

经不同浓度乙醇做夹带剂总黄酮、三萜类及萃余物黄色素的提取率见图2。

乙醇浓度90%时总黄酮提取率最高为（8.691±0.002 89）%，乙醇浓度85%时三萜类提取率最高为（0.387±0.001 15）%，乙醇浓度90%时次之为（0.379±0.000 88）%。超临界萃取中对极性化合物选择性加入一定浓度的极性夹带剂，通过氢键的作用，根据相似相容原理，可以改变物质的溶解性[24]。总黄酮、三萜类分子间引力较大，难溶于水，加入极性溶剂可提高溶解度进而提高提取率[25]。黄酮类物质通常选用乙醇做夹带剂，水分子可以增加溶剂与材料的接触面，由于低浓度乙醇中水分相对较高，可以增加极性物质的溶解性，因此合适的水与乙醇比例可获得较高提取率[26]，乙醇浓度较高时反而导致溶解度降低[26]。

图2 乙醇浓度对总黄酮、三萜类提取率及萃余物超声处理黄色素提取得率的影响Fig.2 Effect of alcohol concentration on extraction rate of total flavonoid，triterpenoids and yellow pigment

进一步利用超声波辅助提取萃余物中黄色素，在90%乙醇浓度下获得的萃余物经超声波辅助提取后黄色素得率达到（6.044±0.004 62）%。也说明超临界萃取黄色素提取量极微，而黄色素在萃余物中残留多。该结果与朱庆书等的结果一致[14]。利用Duncan法分析，不同浓度下总黄酮、三萜类提取率差异显著，此时萃余物中黄色素提取率也差异显著（P<0.05）；综合考虑企业生产效益，选取90%乙醇为最适浓度。

2.1.3 压力对总黄酮、三萜类及萃余物黄色素提取率影响

压力对总黄酮、三萜类及萃余物黄色素提取率影响见图3。

图3 压力对总黄酮、三萜类提取率及萃余物超声处理黄色素提取得率的影响Fig.3 Effect of pressure on extraction rate of total flavonoid，triterpenoids and yellow pigment

经不同压力处理，随压力变化曲线变化趋势明显，30 MPa时总黄酮提取率最高达到（8.126±0.000 58）%，三萜类提取率在35 MPa最高为（0.978±0.001 45）%，30 MPa时提取率次之（0.971±0.002 31）%。在25 MPa～30MPa压力下，夹带剂与黄酮类溶质分子作用活跃，黄酮溶解度更高，萃取率更高。压力过大时，氢键被破坏，导致溶解性下降[27-28]。30 MPa时萃余物经超声波处理提取的黄色素提取率也达到最高（2.991±0.003 46）%。利用Duncan法分析，不同压力下，总黄酮、三萜类提取率差异显著（P<0.05），萃余物中黄色素提取率也差异显著（P<0.05）。因此取30 MPa压力条件为最适压力。

2.1.4 温度对总黄酮、三萜类及萃余物中黄色素提取率影响

温度对总黄酮、三萜类及萃余物中黄色素提取率影响见图4。

随温度从低到高变化各物质提取率从低到高然后降低，80℃时黄酮提取率最高为（11.376±0.002 89）%；75℃三萜类提取率最高为（1.020±0.002 31）%；萃取过程中温度升高能加速分子运动和相互作用，溶解度升高。温度过低时，总黄酮、三萜类分子与溶液分子间作用不充分溶出少[10]。

75℃时萃余物中黄色素经超声波处理提取率最高可达（6.043 3±0.005 21）%，80℃时次之为（5.864±0.005 77）%。利用Duncan法分析，不同温度下，总黄酮、三萜类提取率差异显著（P<0.05），萃余物中黄色素提取率也差异显著（P<0.05）。综合考虑工业生产的效益及目前黄色素提取及纯化在应用中的价值，石榴皮黄酮苷类物质是其主要成分[29]，80℃黄酮类提取率最高，黄色素提取率虽未达到最高，其提取率仅次于75℃条件。因此取80℃为最适温度。

图4 温度对总黄酮、三萜类提取率及萃余物超声处理黄色素提取得率的影响Fig.4 Effect of temperature on extraction rate of total flavonoid，triterpenoids and yellow pigment

2.2 超声波及微波辅助提取黄色素方法比较

在本试验筛选的浓度、时间、温度、压力条件下经超临界萃取后，萃余物经超声波辅助提取和微波辅助提取黄色素进行提取方法选择，结果见图5。

图5 萃余物中黄色素超声波、微波处理提取率Fig.5 Extraction rate of yellow pigment by ultrasonic wave and microwave

由图5可见萃余物中的黄色素经超声波辅助提取法提取率均高于微波辅助法，其中不同温度、压力条件下差异极显著（P<0.01）；不同夹带剂浓度条件下，除了95%乙醇条件均差异显著；不同时间条件下，除50 min作用时间差异显著（P<0.05）外，其余处理时间均差异极显著（P<0.01）。单因素筛选的夹带剂浓度90%乙醇，萃取时间90 min，萃取压力30 MPa，萃取温度75℃条件下经超声波辅助提取黄色素提取率为（6.043 3±0.009 02）%，经微波辅助提取提取率为（5.748 3±0.001 25）%，2种方法提取率差异极显著（P<0.01）。结果表明在本研究设定的浓度、时间、温度、压力条件下进行超临界萃取后进行的超声波辅助提取与微波辅助法比较，超声波辅助提取（100 kHz，20 min）可以使黄色素更充分释放[16]，因此选择超声波辅助（100 kHz，20 min）提取萃余物中黄色素。

2.3 正交试验

2.3.1 正交试验结果

正交试验结果见表2，方差分析见表3。

表2 正交试验结果Table 2 The result of orthogonal test

从表2、表3可以看出，总黄酮最优方案为A1B2C2D3，即 70 min、90%乙醇、30 MPa、85 ℃，各因素影响次序为 B（浓度）>C（压力）>D（温度）>A（时间）。三萜类主次顺序：B（浓度）>A（时间）>D（温度）>C（压力），最优水平A2B2C3D1，即提取条件为90 min、90%乙醇、35 MPa、75℃，此时三萜类提取率1.013%、总黄酮提取率10.654%、萃余物中黄色素提取率5.434%。同时考察了超临界萃取条件对萃余物中超声波辅助提取黄色素的影响，最优组合为A1B2C3D3，即提取条件为70 min、90%乙醇、35 MPa、85℃，各因素的影响次序为D（温度）>B（浓度）>C（压强）>A（时间）。此时，需要对总黄酮及黄色素提取进行验证试验，由最优组合条件可知，总黄酮提取最优条件与萃余物黄色素提取最优条件均为70 min、90%乙醇、85℃，只有压力条件不一致。

表3 方差分析Table 3 The result of variance analysis

2.3.2 验证试验

验证试验结果见表4。

根据表4，组Ⅰ（70 min、90%乙醇、30 MPa、85℃）条件下，超临界萃取总黄酮提取率为（12.482±0.00209）%，三萜类提取率（0.780±0.003 76）%，此时萃余物中黄色素提取率为（5.870±0.00346）%。组Ⅱ（70 min、90%乙醇、35 MPa、85℃）条件下总黄酮、三萜类及黄色素提取率与组I均差异不显著（P>0.05）。考虑到动力学热力学因素及企业生产安全实际，建议选取压力30MPa更为合适，建议取70 min、90%乙醇、30 MPa、85℃组合。

表4 验证试验结果Table 4 The test result

石榴及其衍生物在食品与人类健康方面有很多潜在应用价值[29]，尤其是石榴皮的活性物质提取日益受到关注，本研究关于石榴皮的提取物结果表明超临界萃取石榴皮总黄酮提取率达到12.482%，高于超声波辅助与半仿生酶法（7.34%），与酸石榴皮中总黄酮超声波微波辅助法提取的提取率（11.16%）相当，高于甜石榴皮提取率（10.02%）[5.17-18，30]，此条件下对萃余物中黄色素进行提取纯化，提取率达到5.870%，由于是提取总黄酮等活性物质后再提取萃余物中的黄色素，该提取率与已知的文献中直接利用石榴皮提取黄色素结果相当[13-14]，萃余物提取率高，进行生产与应用的可行性好，且解决了生产废渣废料萃余物的使用问题。

2.4 抗氧化活性

对超临界萃取液的抗氧化活性及萃余物中提取的黄色素进行了抗氧化活性检测，经超临界萃取后提取液及萃余物超声波处理及微波处理后黄色素抗氧化活性见表5。

表5 抗氧化能力测定Table 5 Determination of antioxidant capacity

由表5可知，经超声波处理的黄色素抗氧化能力显著高于微波处理组（P<0.01），超声波处理的黄色素DPPH自由基清除能力及ABTS+自由基清除能力分别为（27 335.16±8.550 1）μmol FERA/g和（4 164.10±4.657 6）μmol Trolox/g，可见经超临界萃取后的萃余物提取的黄色素具有较强的抗氧化活性。

3 结论

以企业生产实际为出发点，超临界萃取时间70min，夹带剂乙醇浓度90%，萃取压力30MPa，萃取温度85℃时，总黄酮提取率为12.482%，同步获取三萜类提取率为0.780%，萃余物中黄色素提取率为5.870%，超声波处理的提取率显著高于微波辅助法（P<0.01）,黄色素抗氧化活性检测DPPH自由基清除能力及ABTS+自由基清除能力分别为（27 335.16±8.550 1）μmol FERA/g和（4 164.10±4.657 6）μmol Trolox/g。研究可有效提高工业生产的效率和效能，并能充分利用超临界萃取残渣（萃余物），达到高值化利用石榴皮的目的，同时缓解企业生产废渣污染问题。