酶法检测肌酐水平降低的秘密：羟苯磺酸钙的干扰

陈克娜 综述，谌海兰 审校

重庆医科大学附属第一医院检验科，重庆 400016

肌酐是一种相对分子质量较低的含氮化合物，是肌肉组织中肌酸的代谢终产物，它主要从肾小球滤过，不被肾小管重吸收，可作为评估肾小球滤过率和肾功能的重要指标[1-2]。目前，临床应用较多的检测肌酐的方法是苦味酸法和酶法。现在实验室应用酶法检测肌酐的有70.4%，苦味酸法检测肌酐的有29.6%[3]。然而，临床上常出现肌酐检测结果和患者临床表现不符的情况。这与实验室所用方法，仪器的特异度和抗干扰能力不同有关，也与多种物质的干扰有关，特别是药物的干扰，且不同药物的干扰方向不尽相同[4]。

羟苯磺酸钙是一种血管保护剂。它通过降低毛细血管通透性、血液黏度和血小板高活性来改善异常的血液流变学和微循环，在治疗糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、慢性静脉功能不全和各种微血管病变中发挥着重要作用[5]。研究表明羟苯磺酸钙对庆大霉素诱导的急性肾损伤也有治疗作用[6]。但是，这一临床常用药物会对酶法检测肌酐产生负干扰[6]，其干扰产生机制尚不明确。探究其干扰机制、寻求消除或减轻干扰的方法是一线工作者的重任。

1 临床常用的肌酐检测方法

目前，应用于临床实验室的肌酐检测方法已达10余种。其中，同位素稀释质谱法是血清肌酐检测的决定性方法[7]，同位素稀释液相色谱串联质谱法是我国肌酐检测的参考方法[8]。由于每种方法的抗干扰能力不同，又受到检测成本和通量的限制，目前临床应用较多的是苦味酸法和酶法。部分肌酐检测方法的比较见表1。

表1 不同肌酐检测方法的比较

1.1碱性苦味酸法 碱性苦味酸法是最经典的肌酐检测化学方法。其原理是肌酐在碱性条件下与苦味酸反应生成橘红色的苦味酸肌酐复合物，通过比色法在505～520 nm波长处检测样品肌酐水平[8]。这种方法最早为临床所用，但其抗干扰能力差，易受到多种非特异性色原的干扰，如胆红素、抗坏血酸、α-酮酸、丙酮、乙酰乙酸、葡萄糖、蛋白质、胍、胍乙酸内酰胺等。尽管实验室对苦味酸法进行了一些改进，比如使用新鲜配制的试剂、给试剂仓加防护罩减少试剂与空气接触、按时定标保证试剂有效性、采用时差法检测肌酐、吸附法去除干扰物等，仍然不能完全解决非特异性色原干扰的问题。

1.2肌氨酸氧化酶法 肌氨酸氧化酶法是酶法中的一种。肌氨酸氧化酶法根据原理不同还包括肌酐酰胺水解酶法和亚胺水解酶法[3]。肌氨酸氧化酶法是国内临床实验室使用最多的肌酐检测方法[9]，其检测原理是肌酐在肌酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶的作用下逐步水解得到H2O2，生成的H2O2通过偶联终点比色法反应生成有色物质，检测肌酐水平[10]。

酶法应用时间较晚，优势显著，但也受到部分干扰物的影响，例如：5-氟胞嘧啶、酚磺乙胺、多巴胺、多巴酚丁胺、硝基甲烷、抗坏血酸、羟苯磺酸钙等。其中，多巴胺、多巴酚丁胺能可逆地黏附于留置导管，使静脉穿刺和留置导管标本的肌酐检测结果差异较大；而肾上腺素和去甲肾上腺素则不会黏附于留置导管，两种类型标本检测结果差异小于5%[11]。另外，免疫球蛋白M会对酶法检测肌酐产生正干扰，这种干扰可以通过超滤法消除[12]。苦味酸法和酶法的几种常见干扰物及其干扰方向见表2。

表2 几种常见物质对肌酐检测的干扰

研究显示苦味酸法和酶法两者检测结果有良好的相关性(r=0.998，P<0.001)，但通过回归分析其斜率和截距发现两者的检测结果不能互换，且当肌酐水平低于180 μmol/L时，与酶法比较，苦味酸法的最大正偏倚为14.1%[10]。在实际应用方面，苦味酸法的灵敏度、精密度、准确度、平均回收率、抗干扰能力均比酶法低，并且由于线性范围略小而无法准确检测高出一定水平范围的肌酐[1]，因此，酶法被越来越多的临床实验室采用。

2 羟苯磺酸钙对肌酐检测的干扰

2.1羟苯磺酸钙的药代动力学 含有羟苯磺酸钙的商品有多贝斯、昊畅、安多明、导升明等。羟苯磺酸钙多为口服，用法一般为500 mg/次，2～3次/日。该药主要以原形通过肾脏、肠道排泄，仅有10%以代谢产物排泄。口服给药后24 h内大约各有50%从尿液和粪便中排泄[18]。健康人群单次口服500 mg羟苯磺酸钙后，3～6 h血药水平可达峰值，其浓度约为8～15 μg/mL；静脉给药500 mg后，5 min血药水平可达峰值，浓度为65 μg/mL[19]。羟苯磺酸钙血浆半衰期在5 h左右[20]，在人体内可达到的谷浓度和峰浓度范围分别是2.66～8.33 μg/mL和12.83～23.15 μg/mL[21]。服用羟苯磺酸钙后的稳态浓度平均为6.64 μg/mL[6]，服用后血药浓度半衰期为稳态浓度的95%左右[9]。

2.2羟苯磺酸钙的作用机制 已有研究证实羟苯磺酸钙在治疗糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变中的疗效和安全性较好[22]。在ZHOU等[23]的研究中，羟苯磺酸钙可降低糖尿病肾病患者的内皮功能障碍标志物水平，例如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、内皮素-1，同时炎症标志物例如正五聚体蛋白3(PTX3)、单核细胞趋化蛋白-1、超敏C-反应蛋白、细胞间黏附分子的水平也降低，但一氧化氮(NO)水平升高，且肾小球滤过率没有变化。通过回归分析发现PTX3、NO和糖化血红蛋白是糖尿病肾病的影响因素。NJAU等[24]研究发现羟苯磺酸钙可抑制VEGF165诱导的内皮细胞通透性、迁移、增殖及血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2)的磷酸化，并且可抑制VEGFR-2介导的信号级联活性。此外，在VEGF满足生理水平以维持肾小球完整性的情况下，羟苯磺酸钙可降低糖尿病小鼠肾脏的VEGF信号，改善糖尿病肾病和周围神经病变。上述研究结果提示羟苯磺酸钙是VEGF的抑制剂，没有完全阻断VEGF的负面影响，可作为治疗糖尿病肾病的有效药物。在ZHANG等[25]的研究中，羟苯磺酸钙通过降低患者纤溶酶原激活物抑制剂-1和纤维蛋白原的水平降低尿激酶和组织型纤溶酶原激活物的活性，从而激活纤溶酶原并减轻肾小球硬化的程度。

2.3羟苯磺酸钙对肌酐检测的负干扰 羟苯磺酸钙应用广、市场价格低，是一种长效使用药物，但体内和体外研究均证实羟苯磺酸钙会对酶法检测肌酐产生负干扰，并且短期内服用没有明显的肾脏保护作用，还会通过负干扰影响肾功能的正确评估[26]。

羟苯磺酸钙对酶法的干扰程度与干扰物及肌酐基础水平相关。当外源添加的羟苯磺酸钙浓度达到4 μg/mL时，与未添加羟苯磺酸钙的肌酐检测结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)[19]，当外源添加的羟苯磺酸钙水平达到8 μg/mL时，即可使8种酶法肌酐检测系统的结果下降4.4%～36.3%[6]，且羟苯磺酸钙水平越高，负干扰越严重。在GUO等[6]的研究中，低水平肌酐受羟苯磺酸钙的干扰最大，其次是中水平、高水平。并且受试者口服500 mg羟苯磺酸钙后的血药水平与肌酐浓度曲线趋势相反，但在此过程中胱抑素C水平没有明显变化，这暗示羟苯磺酸钙与肌酐检测结果呈负相关。羟苯磺酸钙除了对肌酐检测产生负干扰，也会对尿酸、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇、糖化清蛋白等产生一定负干扰[27]，且对尿酸、三酰甘油的负干扰较为明显[21]。

羟苯磺酸钙引起的负干扰对肾功能不全患者可能会产生更严重的影响。对于肾功能不全患者，羟苯磺酸钙对酶法检测的负干扰导致结果假性降低，使患者误认为该药物有明显的改善肾功能的作用，可能出现错误的药物减量或停药。并且肾功能不全患者肾小球滤过率低，药物容易堆积，干扰可能更严重。余久如等[28]的研究也证实了这一说法，特别是当估算肾小球滤过率低于12 mL/(min·1.73 m2)时，稳态血清羟苯磺酸钙水平急剧升高。对于肾小球滤过率正常的患者，服药24 h血药水平均在6 μg/mL以上，所以无论何时采集血液标本都极有可能对酶法检测肌酐产生负干扰[9]。

慢性肾脏病(CKD)分期直接依赖于肾小球滤过率[29]，其结果的差异将影响肾小球滤过率在判断和估计CKD进展中的应用[30]。宋亚男等[26]对服用羟苯磺酸钙合并CKD的患者进行了CKD分组研究，CKDⅠ～Ⅱ期患者的肌酐检测及肾功能评估受到羟苯磺酸钙的影响小，但CKDⅢ～Ⅴ期肌酐检测及肾功能评估受到明显的负性影响，尤其对CKDⅤ期的患者影响更为明显。

2.4负干扰产生机制的假说 羟苯磺酸钙对酶法检测肌酐的负干扰早有报道[6]，但产生负干扰的机制尚不明确。有学者提出了以下3种假说[6]：(1)酶法检测肌酐是基于肌酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶降解肌酐及其反应产物，然后通过偶联终点比色法反应检测肌氨酸氧化产生的H2O2，而羟苯磺酸钙的基本结构是对苯二酚环，它具有还原性，可能会消耗H2O2，从而产生负干扰。(2)羟苯磺酸钙可能与偶联终点比色法反应中的其他成分发生反应，从而减少生色基团的形成，使检测结果假性降低。(3)羟苯磺酸钙可能会影响生色基团的稳定性。第1种假说是被较多学者认可的假说，也是目前试剂厂商等解决干扰问题的出发点。明确羟苯磺酸钙对肌酐检测产生负干扰的确切机制将有利于选择正确的检测方法从而消除或减小误差。

3 讨 论

肌酐是评估肾小球滤过率和肾功能的重要指标之一，最小化血清肌酐的总允许误差水平是临床医生准确诊断急性肾损伤等肾脏病变的必要条件[31]。鉴于肌酐检测会受到多种物质的干扰，建议医师送检血样时说明患者所用药物的名称或嘱患者停用一些对检测有干扰的药物(如羟苯磺酸钙)一段时间后再检测。且对于服用羟苯磺酸钙的肌酐检测结果在进行临床评价时加以高度警惕，结合患者临床症状判断。如果同期尿素、胱抑素C等检测结果没有明显降低，可选用其他检测原理的方法进行复核，也可用酶法和干片法同时检测肌酐，进行结果比较。肌酐检测标本尽量避免使用留置导管血[17]，且不宜采用全血标本及溶血标本[1]，因为红细胞中的假肌酐较多。对于肾功能不全患者，药物蓄积引起的负干扰可能更严重，因此该类患者的肌酐检测结果和药物减量应引起临床足够的重视[9]。

对于肌酐的检测有多种方法，检测原理、试剂盒、检测系统的差异对肌酐检测结果的影响不容忽视，例如目前临床应用较多的酶法与碱性苦味酸法之间存在系统误差，因此各临床实验室要对所用方法进行系统评价，以明确其性能特点及检测局限性[15]。在抗干扰方面，不管是采用酶法还是苦味酸法，干扰物对不同检测系统的干扰程度和方向都可能存在差异，但总体而言干扰物对苦味酸法产生干扰的概率高于酶法[14]。并且在酶法基础上建立的参考方法可以有效完成血清肌酐的检测，此方法与袁鹏飞等[32]验证检测的结果一致，有利于为血清肌酐常规检测系统的方法或物质溯源提供有效途径，因此酶法代替苦味酸法检测肌酐的优势显而易见。