疲劳的动物模型及发生机制研究进展＊

王 智，闫明珠，夏天吉，刘新民，潘瑞乐，周云丰，陶 雪，常 琪

（中国医学科学院/北京协和医学院药用植物研究所 北京100193）

疲劳广泛存在于各类人群中，这与如今人们的生活方式以及紧张繁重的工作状态密切相关。1982年召开的第五届国际运动生化讨论会上正式将疲劳定义为：“机体生理过程不能将其机能持续在特定水平上或器官不能维持其预定的运动强度”。目前临床已经有一些常用的疲劳分类方式，按其发生性质，疲劳分为生理性疲劳和病理性疲劳。生理性疲劳通常是指机体由于体力或脑力劳动时间过久或强度过大造成体内组织器官所需营养物质和氧气供应不足和乳酸等代谢物蓄积增多，进而向大脑发出信号而产生的疲劳感觉。生理性疲劳常表现为疲惫、乏力、身体酸痛和思想不集中等症状，可通过休息而恢复；病理性疲劳顾名思义是由于某种疾病而引发，如帕金森病、癌症、多发性硬化症和创伤性脑损伤等[1,2]，不可以通过休息而缓解。疲劳又可按其发生部位分成中枢性疲劳和外周性疲劳，中枢性疲劳是由于中枢神经系统功能的紊乱所引起，而外周性疲劳通常由中枢以外的原因所造成。因不同类型疲劳间的临床表现较为混杂、分类界限不易明确，所以科研人员也开始逐渐意识到不可根据疲劳的划分类型完全分割开来进行研究，不可单独将疲劳视为中枢神经或外周系统所单独产生的影响，其往往是信号相互作用的结果。

已有研究表明，严重的疲劳可扰乱人体的正常活动，机体在长期处于疲劳状态下会引起睡眠障碍和学习记忆能力下降等症状，影响工作效率，对身心健康产生极大危害[3,4]。因疲劳发病原因广且对机体伤害较为主观，疲劳症状通常不为患者所重视。据统计，由于患癌症而饱受疲劳影响的病人中，只有14%的人接受了疲劳相关的建议和治疗[5]。现有缓解疲劳的药物并不充足，更加稳定有效的抗疲劳药物和保健品急需研制开发。近年来，疲劳问题逐渐为人们所关注，国内外众多学者对疲劳进行了多方面的研究与报道，特别是随着科技的进步和研究手段的提高，有关疲劳的分子机制研究也不断深入。本文就近20年来在抗疲劳药物和保健品研究中所涉及到的疲劳动物模型以及可能的发生机制进行了概况总结，为抗疲劳产品的功效评价和机制研究提供参考。

1 疲劳动物模型

构建有效且稳定的疲劳动物模型对于抗疲劳药品和保健品的研发极其重要。理想的疲劳动物模型应尽可能模拟人类的疲劳体验，并且能够特异性的针对疲劳症状，从而可将其用于更明晰的机制研究。到目前为止，已报道的疲劳动物模型有以下种类，包括采用物理、化学、免疫和炎症、放射线、手术、基因工程和癌因等单一因素或多种因素诱导的方法构建的一系列用于疲劳研究的动物模型。

1.1 物理法

物理法是指采用强迫运动、睡眠干扰或束缚等一系列物理方法导致动物疲劳。Sachdeva和Kumar等[6,7]使白化Laca小鼠每天进行强迫游泳或转轮攀爬训练6 min，连续15或21天可使其在转棒上的运动时间缩短、强迫游泳中不动时间增长和自主转轮运动降低等疲劳状态。Tanaka等[8]将雄性SD大鼠在水深1.5 cm的笼中连续饲养5天，导致其由于睡眠不足而产生如负重游泳力竭时间缩短等疲劳样行为。为模拟人们长时间在狭小环境中工作且得不到适度运动或活动的状态，可对小鼠或大鼠进行长期束缚以诱导出疲劳动物模型。如Park等[9]将雄性C57BL/6J小鼠置于与其紧密接触且无法活动的圆柱形束缚器（长10 cm，直径3 cm）中，每天束缚3 h，共15天可造成小鼠在空场中自主活动降低和强迫游泳不动时间延长等疲劳症状。

为了模拟人们在日常环境中所受到的复杂因素影响，可同时使用上述物理方法进行多重刺激从而造成动物疲劳的模型。Zou等[10]采用雄性SD大鼠，每天于不同时间随机进行电击、冰水游泳和束缚刺激，共23天即可使大鼠出现转轮运动降低、自主活动减少等疲劳现象。Shao等[11]每天采用束缚（置于圆柱形束缚器中4 h）、强迫运动（20 m/min跑步机上运动1 h）、拥挤环境饲养（10只大鼠在一个标准饲养笼中）和嘈杂声中暴露（播放摇滚音乐12 h）4种方法对雌性SD大鼠进行刺激，通过空场检测和悬尾检测可发现，4周的多因素诱导可成功诱导疲劳模型。Zhao等[12]选用雄性昆明小鼠进行睡眠剥夺、强迫游泳、束缚和夹尾造成疲劳。其方法为前2周每天对小鼠进行12 h睡眠剥夺和2次50 min的游泳训练，第3周时每天束缚4 h，第4周进行夹尾刺激最终造成负重游泳力竭时间缩短和空场自主活动降低等疲劳症状。

1.2 免疫和炎性法

免疫和炎性法是通过注射给予动物可诱发免疫反应或炎性反应的物质而造成动物疲劳的方法，这些物质包括免疫诱导剂、活菌、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等。Katafuchi等[13]以3 mg·kg-1剂量对雄性Wistar大鼠腹腔注射聚肌胞苷酸（Polyinosinic-polycytidylic acid，poly I:C），在注射后的第9天大鼠自主转轮活动下降至正常水平的40-60%。He等[14]给雌性BALB/c小鼠每2周腹腔注射0.2 mL灭活布鲁氏菌（共6次）后，其自主转轮活动量大幅下降。Zhang等[15]给予雌性C57BL/6小鼠和雌性C57BL/6 NLRP3 KO小鼠腹腔注射3 mg/kg LPS（Escherichia coli 0111:B4），通过诱导其全身炎性反应而造成其自主活动降低且转棒测试运动能力下降等疲劳症状，并且发现NLRP3/caspase-1通路参与LPS诱导的疲劳行为的机制。Bonsall等[16]于小鼠侧脑室分别注射2、10或50 ng三种剂量的重组小鼠IL-1β诱导其疲劳，可使它们自主转轮运动和自主活动降低。

1.3 基因工程法

所谓基因工程法是指采用基因导入、诱导突变或敲除等技术造成动物体内细胞中基因发生变化而造成的动物疲劳模型。相对于其他模型，该方法可以研究特定基因对于疲劳的调控情况且具有可遗传性。De Groot等[17]通过使用N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）诱变C57BL/6J小鼠，使其Slc2a4基因（编码胰岛素反应性葡萄糖转运蛋白GLUT4基因）中位于第10外显子的一个远端单核苷酸（A到T）发生突变，导致此小鼠体重降低，自主转轮运动降低，表现出明显的疲劳状态。Golumbe等[18]构建了RAG2基因敲除小鼠，使小鼠的免疫力显著降低,通过自主转轮、前肢握力等试验证明了其免疫低下可引起疲劳。该模型在一定程度上模拟了临床人体免疫系统受到抑制或缺失时的疲劳状态。

1.4 化学法

化学疗法是恶性肿瘤的重要治疗手段之一，但在抑制及杀灭肿瘤细胞的同时也会对机体造成不良影响，如食欲下降、恶心呕吐、白细胞和红细胞减少、免疫低下等，因此机体会产生严重的疲劳感觉。化学法造模即通过给予动物化疗药物来模拟化疗过程中所致的疲劳状态。Ray等[19]连续5天对雌性BALB/cJ小鼠眶静脉窦注射10 mg·kg-1紫杉醇造成小鼠转轮和空场中的自主活动量降低、悬挂时间减短等疲劳样行为。Dougherty等[20]选用雌性C57BL/6NCr小鼠每天腹腔注射一次5-氟尿嘧啶（60 mg·kg-1），连续5天造成其空场中自主活动量减少和跑台运动能力降低等疲劳表现。

1.5 放射法

同化疗法一样，放射线疗法也是临床用于治疗恶性肿瘤的重要方法之一，它在杀伤癌细胞的同时，对正常组织细胞也产生损伤，因此引发机体疲劳。为模拟放疗病人的疲劳情况，可通过放射法造成小鼠的疲劳模型。Wolff等[21]使用GammaCell 40辐射器对麻醉状态下的雄性C57BL/6小鼠进行每天8 Gy、连续3天的下腹部辐射，导致小鼠疲劳，表现出自主活动量降低等疲劳样行为。McDonald等[22]使雄性C57BL/6小鼠接受每次2.84 Gy、每周5次、共24次，累计68.2 Gy的盆骨外照射放疗，使其自主转轮运动减少，模拟了前列腺癌在外周放射治疗下所致的疲劳状态。

1.6 癌因性

癌症患者由于其贫血、内分泌失调、新陈代谢异常、以及炎性反应等影响而常常会感觉到疲劳且在癌症漫长的治疗过程中，仍然会长时间存在身体和精神上的疲劳现象[23]。为了模拟癌症患者产生的癌因性疲劳，可通过移植癌细胞构建癌症动物从而造成疲劳动物模型。Norden等[24]通过在雌性CD2F1小鼠肩胛骨之间皮下接种colon26细胞建立了模拟肿瘤患者的疲劳模型。接种后小鼠肌肉质量降低，且自主转轮活动下降，3周时握力下降。Bohlen等[25]在雌性C57BL/6小鼠左侧靠近第4乳头的乳腺脂肪垫中植入E0771细胞以模拟乳腺癌患者疲劳，结果显示第4周时出现显著的肌肉疲劳现象。

1.7 卵巢摘除法

女性随着更年期的到来，体内激素水平发生改变从而产生肥胖和肌肉丢失等情况。Lin等[26]选用雌性ICR小鼠进行卵巢摘除手术，造成小鼠负重游泳力竭时间缩短及抓力减小等疲劳表现。卵巢摘除法以造成由于激素水平改变而引起的雌性小鼠体力疲劳状态，用于抗疲劳功效评价的模型。

由于疲劳是一种主观感受，所以在有关疲劳的动物研究中很难对其进行准确的描述和测量，这给研究造成了一定阻碍。各种原因所导致的疲劳均在体力疲劳上有所体现，表现在体力降低和疲乏等，故目前对疲劳的评价都是以体力疲劳的行为学检测为依据。迄今为止，常用的体力疲劳行为学检测方法有强迫运动和自主运动两大类。强迫运动方法中包括负重强迫游泳检测、前肢握力检测、攀爬检测、转棒检测、跑台检测、转轮检测、悬挂检测和悬尾检测等，这类方法通常是通过衡量动物在被迫运动达到极限时所做的运动时长、运动量或肌肉力量，从而对其体力的疲劳状况进行判断。通过自主活动评价疲劳发生情况则是在不给动物任何干预的情况下，通过评价其在空场中的自主活动量或自发进入转轮中的运动量来反应其疲劳程度的，此检测方法的原理与临床疲劳患者的主动运动量减少相似。

2 疲劳的发生机制

目前人们对疲劳发生的机制提出了一系列学说，包括能量耗竭学说、代谢产物堆积学说、内环境稳态失调学说、自由基影响理论和中枢神经系统保护性抑制学说。在抗疲劳研究中，学者基于以上机制对相关生化指标进行检测从而对疲劳的发生及其内在原因进行判断。

2.1 能量耗竭学说

研究表明机体主要能源物质如高能磷酸物、血糖（glucose，Glu）和糖原等被大量代谢消耗是疲劳发生的主要原因。三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）中的高能磷酸键水解可快速释放能量，运动时需要消耗大量ATP，Ca2+-Mg2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶是ATP水解过程中的主要酶，疲劳状态下线粒体受损，其活性较低[27]。糖是运动的主要能量来源，机体通过糖的有氧氧化和无氧氧化产生能量生成ATP，机体疲劳往往伴随着糖类能源物质耗竭产生。当机体运动时Glu先被代谢进行供能，随运动量增加机体进一步大量消耗肝糖原和肌糖原。因此，对抗肝糖原和肌糖原的补充常常被用来评价抗疲劳保健品的功效。血清中脂肪代谢的标志物为非酯化脂肪酸（nonesterified fatty acid，NEFA）和甘油三酯（triglyceride，TG），它们也可作为疲劳生化检测的重要指标[28,29]。NEFA含量增加，TG含量减少表明运动期间脂肪代谢增加，糖原消耗率降低，抗疲劳运动表现加强。肝脏和肌肉组织中与能量代谢相关的酶，如丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）、琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）和苹果酸脱氢酶的（malate dehydrogenase，MDH）活性可以进一步反应疲劳的状态[30]。线粒体活化蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK）及其相关通路具有协调代谢和能量的重要作用，与机体疲劳的发生密切相关。激活AMPK不仅可以促进Glu摄取和增加糖原利用等，还可通过激活下游过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1（peroxlsome proliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α，PGC-1α）促进肌肉内线粒体氧化代谢和生物合成，从而促进肌纤维类型转化，红肌比例增大，表现出抗疲劳作用[31-32]。

2.2 代谢产物堆积学说

代谢产物堆积学说认为在大量运动之后机体内乳酸、氨等代谢产物大量积累从而造成疲劳的产生。在剧烈运动时肌肉内糖的无氧氧化增加，产生的乳酸大量堆积会降低肌肉组织和血液中pH值，抑制肌肉收缩从而造成疲劳。血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）是氨基酸、蛋白质代谢的产物，在剧烈运动时机体会进一步消耗蛋白质进行供能，血清中尿素氮的增加，引起机体疲劳。运动后当血清尿素氮相比含量较低时，说明蛋白质分解减少，运动耐受能力增加[33]。其血氨（blood ammonia，BA）降低也可以有效保护中枢神经从而减轻疲劳[28]。

2.3 内环境稳态失调

正常生理状态下，机体的内环境各组分如K、Na、Ca、Mg等离子处于稳定的动态平衡状态。当剧烈运动后这些成分的浓度会发生紊乱，造成内环境平衡失调从而引起疲劳。剧烈的肌肉收缩引起细胞K+外排、Na+和Cl－内流，细胞外和细胞内K+和Na+浓度明显变化。Na+-K+-ATP酶活性增加可以稳定Na+和K+的浓度梯度和细胞膜兴奋性，在剧烈运动时，一部分Na+-K+-ATP酶失活，离子浓度紊乱产生疲劳[34]。Ca2+在肌肉收缩过程中发挥重要作用，剧烈运动会使Ca2+从肌浆内质网泄漏，肌肉收缩力变小，松弛时间明显延长，从而使得疲劳加重[35]。Mg2＋是许多细胞过程中必不可少的因子，研究发现慢性疲劳综合征患者的静息游离Mg2＋水平更高[36]。ATP是Mg2＋重要的结合位点，ATP的大量分解可能是疲劳时Mg2＋增加的一个来源[37]。

2.4 自由基影响理论

自由基是机体新陈代谢过程中产生的具有未成对电子的物质。由于其化学性质非常活跃，可与多不饱和脂肪酸、蛋白质和核酸等发生争夺电子的作用。机体在大量运动后，体内氧化代谢增强，骨骼肌、心脏、肝脏等组织内产生大量的自由基，无法快速清除的自由基可导致脂质、蛋白质和核酸等氧化损伤[38]。当脂质过氧化反应加强，可破坏细胞膜及多种细胞器使细胞正常的代谢功能受损，产生机体疲劳；并且大量运动产生的活性氧自由基还会诱导蛋白质氧化从而导致肌肉疲劳[39]。

在抗疲劳产品的活性评价和机制研究中，可以通过机体的抗氧化能力来反应其抗疲劳水平。谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）是体内主要的抗氧化酶，通过测定机体内这些酶的活性可以间接反应被测物的抗疲劳效果[40]。还可以通过测定血清以及肌肉组织的总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）来了解自由基对组织的损伤程度[41]。氧化应激会造成细胞膜的完整性受损从而诱发细胞损伤，因此也可以通过检测细胞氧化损伤后的标志物进行疲劳程度的评价。丙二醛（malondialdehyde，MDA）为细胞膜脂质过氧化产物，其在体内的水平通常被作为判断疲劳状态的指标。血清中碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）和 乳 酸 脱 氢 酶（lactate dehydrogenase，LDH）是肌肉损伤的标志物，当血清中其含量减少时表明药物对肌肉细胞起保护作用[28,42]。心肌细胞和肝细胞被氧化损伤时谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和 丙 氨 酸 转 氨 酶（alanine aminotransferase，ALT)会渗漏到血清中，可通过对血清中其水平的监测进行疲劳情况分析[43]。核因子E2相 关 因 子2（nuclear factor erythroid-2-related actor 2，Nrf2）是调节细胞抗氧化反应的关键分子，并调节下游血红加氧酶-1（heme oxygenase 1，HO-1）、硫氧还蛋白（thioredoxin,Trx）和B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma，Bcl2）等信号，其在肝脏和肌肉组织中表达增强也提示抗疲劳能力的提高[30,44]。并且疲劳发生过程中的氧化应激还可引起炎症反应，从而使肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）和 白 介 素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等多种炎性细胞因子发生改变[41,45]。

2.5 中枢神经系统的保护性抑制学说

中枢神经系统对机体的运动具有自我保护作用。机体在过度运动中大量神经冲动会传导到大脑皮层，引起神经长时间兴奋，多种神经递质如5-羟色胺、多巴胺积累或消耗，神经细胞消耗过多[46]。为避免机体的这种大量消耗而导致的损伤，大脑皮层进行保护性抑制调节从而产生机体疲劳。

3 小结和展望

引起疲劳的原因众多，不同的诱因所产生的疲劳感受也不尽相同。通过强迫运动或应激等物理造模方法可模拟因短时剧烈运动或长期过度运动、或因紧张的生活工作压力而导致的生理性疲劳；而通过免疫或炎性反应、移植癌细胞造成癌症、放化疗和卵巢摘除手术等手段造成的动物慢性疲劳模型亦可很好地模拟因疾病引发的病理性疲劳；此外，还可通过叠加上述多种诱因来造成复合因素所致的疲劳。当今人们的生活习惯和工作性质较以往发生了很大改变，因此疲劳的表现也有很大不同，除了体力上的疲劳外，还常常伴有精神上的疲劳，比如精神不集中、兴趣低落等。因此，在进行抗疲劳药物和保健品研究过程中应针对疲劳发生的原因和类型选择更加贴合的疲劳动物模型，从而更有效地评价其功效，开发出更加符合该疲劳发生机制的产品。并且，在抗疲劳药物和保健品的研发中，科研人员应关注到中药可能具有的更大优势。相比化学药，中药可以从多器官、多层次发挥功能，且在可能长期服用的过程具有相对更小的毒副作用和成瘾性。

此外，目前虽有上述一些被广泛认可的疲劳发生机制学说，但其潜在的病理生理机制尚并不明晰。现在，许多学者都对疲劳背后的骨骼肌功能和神经生物学产生了浓厚兴趣，揭示了其可能与肌纤维类型、中枢神经系统的调控和昼夜节律等相关。在疲劳发生的机制研究中还应当将中枢与外周结合起来，多角度和多水平进行研究，探究其内在的调控网络。关于不同起因产生的疲劳还有待于科学工作者进行深入细致的研究，希望能在其中找到共同的神经生物学基础为临床疲劳的治疗提供有力支撑。