高强度聚焦超声消融术联合免疫检查点抑制剂治疗神经母细胞瘤的回顾性分析

刘勇志，张菊

(重庆医科大学附属第一医院肿瘤科，重庆 400010)

0 引言

高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound, HIFU)是治疗肿瘤的一种新方法。HIFU 主要通过机械效应、热效应、空化效应对肿瘤细胞进行破坏。近年来，国内外许多研究表明HIFU 不仅可以降低肿瘤体积，还可以抑制肿瘤转移，提高患者的抗肿瘤免疫能力。免疫检查点抑制剂则通过阻断免疫检查点可以间接活化T 细胞，增强免疫反应，提高机体的抗肿瘤免疫。而解除肿瘤对机体免疫的抑制作用。从而引发更强的抗肿瘤免疫，达到更长的生存期。因此，我们认为接受HIFU 治疗的恶性肿瘤患者可能从免疫检查点抑制剂中获益更多。但这一观点仍需要临床研究的证实。

1 高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound, HIFU)的抗肿瘤免疫效应

高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound，HIFU)的机制是将体外低能量的超声波聚焦于人体内的目标治疗区域，并使该区域快速升温至 65℃～100℃，导致局部产生蛋白质变性和凝固性坏死；同时，高强度聚焦超声可以产生空化效应，使靶区内细胞的气体原子核发生扩张，从而协同声压的影响，促使细胞内的膜结构(如细胞核膜)瓦解。与常规手术相比，HIFU 治疗对肿瘤患者的自身免疫功能影响更小，术后恢复更快。HIFU 术后并发症主要分为手术热效应损伤(如皮肤烧伤，附近骨、神经烧伤)和非热效应损伤(如疼痛、发热、局部感染、肠穿孔)。研究发现(或：“临床数据显示”，但也要添加参考文献)大部分患者术后并发症较轻，暂未发现严重不可逆损伤。目前，有研究发现与肿瘤部分切除、局部姑息性放疗等治疗相比，姑息性治疗联合HIFU 治疗的患者具有更长的生存期及无瘤生存期，并拥有更高的生活质量[1-4]，这可能与HIFU 治疗后患者的抗肿瘤免疫效应提高有关。目前对于HIFU 提高患者抗肿瘤免疫效应的机制，主要有以下几种说法：(1)HIFU 可以通过降低肿瘤负荷，恢复部分免疫功能；(2)HIFU 通过破坏肿瘤细胞，释放具有抗原性质的肿瘤细胞碎片，激发机体免疫；(3)HIFU 通过诱导产生热休克蛋白，增强抗肿瘤免疫效应。

2 免疫检查点抑制剂的现状

肿瘤的发生、发展和转移不仅和多基因突变有关，还与肿瘤细胞免疫逃逸和异常细胞信号通路有关。肿瘤细胞可以通过多种途径躲避机体的免疫监视与杀伤。其中，诱导CD8 +T 淋巴细胞的凋亡是肿瘤细胞免疫逃逸的主要机制。肿瘤细胞可以表达程序性死亡受体配体(Programed Death Ligand 1，PDL1)，并与T 淋巴细胞表面的程序性死亡受体(Programed Death 1，PD-1)偶联，产生抑制信号并诱导 CD8 + T 淋巴细胞凋亡。

免疫治疗经过几十年的艰难摸索，从最开始的注射细菌、输注细胞因子，肿瘤浸润淋巴细胞疗法，过继淋巴细胞疗法等疗法都相继失败，直至今日，免疫检查点抑制剂逐渐进入了肿瘤治疗的舞台。免疫检查点是免疫抑制性通路，目前临床上主要使用的免疫抑制剂包括PD-1 通路抑制剂和CTLA-4 通路抑制剂，其功能是抑制T 细胞活化和增殖，传递负性调节信号。而通过阻断免疫检查点可以间接活化T 细胞，增强免疫反应，提高机体的抗肿瘤免疫，解除肿瘤对机体免疫的抑制作用。从而引发更强的抗肿瘤免疫，达到更长的生存期。

尽管免疫治疗具有较大潜力，但免疫治疗并非在所有癌症患者中都显示较好的疗效[5,6]。接受免疫治疗的患者即使初治有效，仍可能在治疗一段时间后出现肿瘤进展或复发，这可能是由于抗原呈递功能受损，导致T 细胞对肿瘤细胞识别不足[7,8]。因此肿瘤治疗中局部和全身治疗都需要考虑免疫治疗的耐药性问题，并将免疫上的“冷”肿瘤转化为具有免疫反应性的“热”肿瘤。

3 神经母细胞瘤的治疗现状与实验进展

神经母细胞瘤是第三种最常见的儿童恶性肿瘤，它起源于腹部、胸部或颈部发育中的交感神经神经节[9,10]。近年来，随着包括高剂量化疗、放射治疗、自体干细胞移植和免疫治疗在内的多种治疗方式的加入，儿童高危神经母细胞瘤患者的存活率有所提高[11]。仅管进行了强化治疗，但因急性和晚期副作用相关的治疗成本很高，仍有超过50%的患者难以生存[12]。神经母细胞瘤细胞通过降低人白细胞抗原(HLA)-I 类和II 类[13,14]从而逃避先天和适应性免疫系统，并可能被患者T 细胞[12-14]忽略。各种为促进基于免疫治疗的策略所做的各种努力，包括对二亚神经节苷脂(GD2)特异性的工程T 细胞、直接靶向GD2 的单克隆抗体、ɣδT 细胞和疫苗治疗，改变了神经母细胞瘤的治疗前景[17-19]。免疫检查点抑制剂治疗是几种成人肿瘤癌症治疗的最新进展，但在儿科实体肿瘤恶性肿瘤[5,17,21]中，类似的反应尚未得到重视。儿童神经母细胞瘤缺乏治疗效果是由于TGF-β和IL-10 的上调，以及激活NK 上表达的受体的配体的下调和激活T 细胞[12,22]。天然抑制造血干细胞分化、树突状细胞(DCS)的产生、T 细胞增殖以及细胞和体液免疫反应对神经母细胞瘤肿瘤细胞的表型在人和小鼠(Neuro2a)宿主[23,24]中有着惊人的相似之处。对肿瘤微环境进行敏化和改变，以提高检查点抑制剂治疗的疗效，从而导致全身肿瘤消退[25]。微创治疗，如射频(RFA)和冷冻消融已被用于在临床上进行肿瘤消融，介导炎症反应[26-28]。高强度聚焦超声(HIFU)是一种完全无创的消融治疗方法，用于临床热消融实体瘤[29,30]。然而，使用RFA和HIFU 的热消融治疗时可能由于热相关的肿瘤固定而对免疫不利，导致肿瘤对免疫细胞的通透性差以及缺少抗原释放[31,32]。除了热消融外，HI FU 还可用于机械分馏肿瘤，因其具有最小的热效应，又被成为组织成熟[33-35]，这项技术可能提高抗肿瘤免疫敏感性。目前有相关研究描述了HIFU 的治疗模式，即沸腾的组织成熟(BH，这里将被称为‘HIFU’)，这是一种能精确机械分割肿瘤的较高空间精度，使用临床HIFU 系统进行消融[33-35]。HIFU 介导的肿瘤分瘤可能导致免疫原性细胞死亡，并在治疗区内形成原位肿瘤碎片库，增加该区域炎性反应，从而促使免疫敏化[32,39]，而该反应却不太可能出现在HIFU 消融术后，因为完整的HIFU 消融治疗后该组织缺乏肿瘤通透性[31]。

有实验表明[40]，HIFU 治疗与αCTLA-4+αPD-L1 联合治疗难治性单侧神经母细胞瘤可以显著延长荷瘤小鼠的生存时间，而单独使用HIFU 或单独与单个免疫检查点抑制剂联合治疗对于延长荷瘤小鼠生存时间是无效的。单独在HIFU 治疗后24小时，在接受治疗的肿瘤中观察到CD4+和CD8α+细胞的显著浸润，与未治疗的肿瘤相比，在48 小时内CD68+细胞显著增加。在HIFU 治疗后24 小时测量脾脏和肿瘤引流的淋巴结N K 细胞(D X5+)数量显著增加，此时DC(CD11c+)脾脏、肿瘤引流的淋巴结和对侧淋巴结的数量也适度增加。该现象表明，HI FU后肿瘤局部免疫细胞浸润的早期和明显增加。而进一步的研究显示[40]，未经HIFU 治疗的神经母细胞瘤无PD-L1 表达，HIFU治疗后72 小时，大多数肿瘤细胞的PD-L1 表达显著增加，因此，抗PD-L1 治疗是对抗这种效应和增强抗肿瘤免疫反应的关键。与此同时，实验表明在HIFU 后24 小时，白细胞介素-2(IL-2)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CS F)显著增加，血管内皮生长因子- A(VEGF-A)显著减少。在HIFU 治疗后48 小时白细胞介素-6(IL-6)显著上调，而白细胞介素-10(IL-10)的浓度显著降低。此外，在HIFU 治疗后72 小时，IL-10 继续显著下降，而干扰素-Ɣ(IFN-Ɣ)在72 小时显著升高。HIFU 治疗后的24、48、72 小时这三个时间点的肿瘤内遗传模式中，S100 钙结合蛋白A8(S100a8)，S100 钙结合蛋白A9(S100a9)，热休克蛋白家族成员7(Hspb7)，脂钙蛋白2(Lcn2)均显著过表达，而热休克蛋白家族A 成员1B(Hsp70)和CD72 表达在HI FU 后24 小时和48 小时均显著表达，高迁移率组盒1(Hmgb1)表达在HI FU 后没有改变。因此，从细胞变化、细胞因子和遗传特征中得到的集体证据表明，HI FU 治疗难治性的神经母细胞瘤会导致肿瘤、淋巴结和脾脏中早期免疫细胞的存在，从而将非免疫原性的“冷”肿瘤转化为免疫原性的“热”肿瘤。这一理论在后续的实验中也得到证实，系统免疫效应在HI FU 联合αCTLA-4+αPD-L1 后持续，并导致全身“脱落”效应和延长生存期。使用HIFU 联合CTLA-4+αPD-L1 进行部分肿瘤分馏治疗会导致脱落效应，并显著延长先前无法治疗的大的单侧和双侧小鼠神经母细胞瘤肿瘤模型的存活时间。该实验为HIFU 治疗提供了一个概念上的证明：HIFU 能激发全身免疫系统，并且可以作为检查点抑制剂治疗的佐剂。这种全身抗肿瘤作用是通过上调树突状细胞、肿瘤浸润的T 细胞、促炎细胞因子和DAMPs 以及同时下调Foxp3、IL-10 和VEGF-A 等肿瘤前调节因子来介导的。此外，这种联合治疗引发了一种全身效应记忆反应，导致肿瘤再发的排斥反应，并且可以被采纳转移。部分肿瘤分割难治性神经母细胞瘤的小鼠使用HIFU 增强先天和适应性细胞免疫，将“冷”非免疫源性肿瘤转化为“热”免疫原性肿瘤。将这种HIFU 模式与αCTLA-4+αPD-L1 治疗结合，可诱导有效的全身免疫，并治疗大多数具有大的单侧和双侧神经母细胞瘤的小鼠。与此同时，HIFU 治疗这些肿瘤可导致长期免疫记忆。迄今为止，仅有动物实验，尚未有临床使用HIFU 与免疫检查点抑制剂联用进展报道。

4 小结

目前国内外公认肿瘤最佳的治疗方式是多学科综合治疗，既要兼顾全身治疗同时又要妥善进行局部治疗，才能使患者获得最佳的疗效，同时对于治疗过程中可能产生的不良反应尽量控制在最小范围。全身治疗包括化疗、分子靶向治疗、免疫治疗、基因治疗、中医中药，还有营养和心理、精神支持。局部治疗包括外科、血管介入、各种局部的毁损治疗，如射频消融、微波消融、HIFU、冷冻和化疗药物局部治疗。HIFU 只是众多局部治疗手段的一种。现有报道也充分说明单靠HIFU 技术并不能达到理想的肿瘤治疗效果。但是综上所述，HIFU 治疗与免疫检查点抑制剂的联合治疗已经被动物试验证实治疗大的单侧和双侧神经母细胞瘤有效，故可以为临床治疗神经母细胞瘤提供一个新思路。