苦荞黄酮的提取工艺及测定方法研究进展*

苏学军，梅 颖，赵 静

（泰州职业技术学院，江苏 泰州 225300）

苦荞又名鞑靼荞麦，是一种对恶劣生存环境具有较强适应能力的药食同源作物[1]，在我国西南、华北地区广为栽培与种植，具有卓越的营养及保健功效。苦荞蛋白生物价高、人体必需氨基酸种类齐全，其膳食纤维含量丰富，所含脂肪酸主要为不饱和的油酸和亚油酸，并含多种维生素和矿物元素[2,3]，更为重要的是苦荞中含有与人体健康紧密相连的多酚、多糖、活性肽等多种生物活性成分。其中，多酚中的黄酮类化合物是苦荞中含量最多、也是最重要的活性成分，它包括芦丁、槲皮素、山奈酚和花青素等[1]，遍布于苦荞的花、茎、叶、籽粒等器官中。苦荞黄酮能够降血糖、降血脂、抗缺血、清除体内自由基、抑制癌细胞增殖、改善记忆力，药用功效显著[4]。本文综述了苦荞黄酮的提取工艺及含量测定方法，以期为进一步推动苦荞资源的综合利用，提供科学依据。

1 提取方法

1.1 溶剂浸提法

黄酮类化合物因结构和存在状态不同，其溶解度也存在较大差异。水、甲醇、乙醇是传统的黄酮提取溶剂，提取时一般根据目标物的极性大小，常选择一定浓度的醇-水溶液浸提。按操作方式可分为热回流提取、索氏抽提、热水浸提等。米智等[5]以浓度为80%的乙醇溶液为提取剂，采用索氏抽提法提取苦荞黄酮，经正交实验优化后，发现在最佳工艺条件下需提取3 次，回流1.5h，黄酮才有较高得率。扶庆权[6]的研究表明，加热回流条件下，苦荞黄酮最优提取工艺条件为：使用体积分数为70%的乙醇溶液，在80℃下连续回流1h，此时苦荞总黄酮提取率可达7.85%。这些研究表明，采用溶剂浸提法提取，设备简单，操作成本低，但存在操作费时，能耗高，溶剂用量大且回收难等缺点。

1.2 超声波辅助提取法

苦荞黄酮的提取过程是一个相际间的传质过程，即黄酮在浓度差的作用下由苦荞组织内部向提取剂进行渗透扩散。超声波产生的强烈的空化效应、机械效应与活化效应[7]，极易破坏植物的细胞壁，加速细胞内黄酮的释放。同时，超声场引起的搅拌、扰动、湍动和旋涡运动，使传质阻力减少，提取剂的穿透力增强，这有助于苦荞黄酮的高效率提取。王斯慧等[8]采用超声波辅助乙醇提取苦荞麸皮中的总黄酮，研究表明，与传统有机溶剂提取工艺相比，超声波提取可降低提取温度，缩短提取时间，且得到的黄酮化合物的纯度及二次提取率均较高。王丽娟等[9]在提取黑苦荞中黄酮类化合物时，利用单因素及正交实验优化了超声提取工艺，得优选后的工艺条件为：在超声功率400W 条件下，体积浓度为80%的乙醇按料液比1∶15（g∶mL）在60 ℃下浸泡提取，黄酮提取率为4.58%。上述试验表明，超声波辅助提取具有操作易、效率高、产物品质高、提取成本低、生产周期短等优点，但在超声场下进行规模提取尚有困难。

1.3 微波辅助提取法

微波的辅助作用可归因于其穿透溶剂后能直接深入细胞内部，产生的微波能可为细胞吸收并快速转换为热能，使细胞内部温度瞬间升高，致压力激增，当细胞壁无法承受高压时便发生破裂，细胞内部目标组分得以释放，并迅速传递至周围溶剂而溶解。微波产生的热效应，可提高扩散系数，并使固液界面间的有效层流膜层变薄，增强了传质的推动力，提高了黄酮的得率。李富兰等[10]以提取率为目标，研究了苦荞茶中黄酮的提取工艺，得出苦荞茶粉末按1∶20（g∶mL）料液比加入浓度为70%的乙醇溶液，微波功率300W，提取时间3.0min，该最佳组合条件下黄酮的提取率可达4.13%。梁虓等[11]将微波提取技术与传统回流提取法相结合，对苦荞籽样品先进行微波预处理，然后于80℃下水浴回流提取，响应曲面法优化出最佳提取工艺条件，经验证试验表明，黄酮得率为5.02%，与预测模型符合度较好。相比于其他提取方法，微波法具有选择性高，可节省溶剂，提取时间短，安全环保等优点；不足之处是提取过程温控不易操作，会产生局部过热现象，部分黄酮可能会分解失活，影响了产品品质及最终得率。

1.4 超临界萃取法

超临界萃取法是利用某些萃取剂在超临界区所表现出的特殊的溶解性能来实现对目标物的萃取，并通过改变温度和压力让萃取剂和目标物分离的一种现代萃取技术。郭月英[12]以荞麦壳为原料，研究了超临界CO2萃取苦荞黄酮工艺，得出最优工艺条件为：选择乙醇为夹带剂，控制萃取压力25MPa，固液比为1∶10，35℃下萃取4h。谭光迅[13]的研究表明，压力和温度是影响超临界萃取的主要因素，萃取前若能将萃取釜保压一段时间，可以使苦荞黄酮的提取率提高近33.33%。超临界萃取可在常温下操作，操作条件易控，无有机溶剂残留，特别适合于非极性化合物的提取，但该法存在设备投资费用较高，日常维护繁琐等缺陷。

1.5 超高压提取法

超高压提取技术是指在超高压釜内加压，使密闭体系压力升至100～1000MPa 处理植物原料，使细胞组织结构发生破坏，目标组分得以更多更快地转移到提取溶剂，进而获得高提取效率的一种新兴提取技术[14]。王居伟等[15]研究了超高压法提取苦荞黄酮工艺，采用Box-Behnken 试验设计优化确定最优工艺条件为：压力388.1MPa，保压时间8.09min，乙醇体积分数为95.31%，液料比为19.82（mL∶g），在此条件下提取的苦荞黄酮得率为2.185%，而传统回流提取法只有1.982%。该法提取耗时短，可在常温下操作，能很好地保留黄酮的生物活性。

1.6 酶辅助提取法

因目标化合物主要存在于植物的细胞壁内，而细胞壁的致密结构使活性组分难以扩散到提取溶剂中，若经恰当的纤维素酶、果胶酶处理，则可提高细胞壁的通透性，增加溶剂的可及性，降低溶出阻力，还能在一定程度上提升产品的品质。李会瑞等[16]研究了纤维素酶提取苦荞茶中总黄酮工艺，在醇提条件不变的情况下，考察了酶解pH 值、酶用量、酶作用时间等因素对提取率的影响，经响应面分析优化确定：酶用量0.6%，在pH 值为5.0、40℃条件下，酶解90min，苦荞茶中总黄酮提取率为1.497%。与乙醇浸提法相比，酶解法使总黄酮的提取率增加了34%。

1.7 减压内部沸腾法

减压内部沸腾法是目前应用于植物活性组分提取的一种较为高效实用的提取技术。该法是让低沸点的有机溶剂充分渗入植物组织内部，然后加入沸点较高的热溶剂，在一定的真空度下使内部有机溶剂迅速发生沸腾而汽化，进而加快被提组分解吸的一种提取方法。王九峰等[17]的研究表明，采用减压内部沸腾法提取苦荞籽粒中的总黄酮时，通过Plackett-Burman 实验筛选出对总黄酮得率有显著影响的实验因子为真空度、乙醇浓度、提取时间和提取温度，而溶剂用量不是显著因子。再以响应面法优化出最佳工艺参数，发现黄酮得率最高时提取温度较低，为52℃，提取时间仅需5min。由此可见，内部沸腾法在天然活性成分提取方面有着独特的优势，可以减少高温对活性组分的破坏，缩短提取时间、降低溶剂的使用量，且在一定程度上提高了提取效率。

2 测定方法

2.1 光谱法

光谱法是测定苦荞中黄酮类化合物应用广泛且重要的分析方法，主要有紫外可见分光光度法、荧光光度法、流动注射分光光度法等[18]。其中，分光光度法因操作简单、设备及检测投资少、准确度高、重现性好而成为目前苦荞中总黄酮测定最常用的检测方法。该法是利用黄酮类化合物能与一些金属离子发生络合作用，生成稳定的有色络合物，然后在特定波长下测出吸光度，来实现定量分析，常使用的络合剂为Al（NO3）3和AlCl3。

王锐等[19]采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH 比色法，对云南昭通大山包的系列苦荞产品中的总黄酮含量进行测定。经方法学考察，该法简便快捷，结果可靠，研究发现黄苦荞仁中总黄酮含量较黑苦荞仁中要高，苦荞仁经炒制加工后黄酮含量会增高。韩旭等[20]系统比较了Al（NO3）3-NaNO2-NaOH 和AlCl3-NaAc 两种方法在对苦荞酒中的总黄酮进行分析测定时的差异，结果表明，Al（NO3）3-NaNO2-NaOH 法测定的结果偏高，分析可能是苦荞中的一些多酚类物质，如肉桂酸类、原花色素等物质在510nm 处参与了显色。因此，AlCl3-NaAc 法测定苦荞黄酮的专属性高，结果更为可靠，需要注意是使用AlCl3-NaAc 法应在显色反应发生后30min 内进行测定，否则结果会发生偏差。

由于黄酮能与铝离子在一定条件下形成稳定的强荧光络合物，近年来，荧光分光光度法测定苦荞中黄酮已引起学者们的关注。李小梅等[21]建立了一种流动注射液滴荧光增敏法测定苦荞中的芦丁含量测定方法。样品经超声振荡萃取后，含芦丁的上清液中加入适量0.1mol·L-1的Al3+，生成了Al3+-芦丁络合物，再选择激发波长239nm、发射波长507nm 测定荧光强度，该法的检出限较低，为0.02mg·L-1，回收率为86.0%～104%，RSD 为3.1%～6.1%。实际检测时要注意络合物的荧光强度会受共存的金属离子Cr3+、Hg2+、Fe3+的干扰。

2.2 高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）分析黄酮类化合物具有灵敏度高、进样量少、可批量测定等优点，能满足苦荞中多种黄酮类组分的同时测定。对苦荞黄酮进行定性定量分析时，常与紫外、荧光、二极管阵列检测系统相结合，可以快速、准确实现对目标组分的检测，适用范围较广。

张继斌等[22]采用HPLC 法测定四川、云南、贵州、陕西不同产地的苦荞麦中黄酮类成分，先以热水浴回流提取样品中活性组分，再以乙腈-0.1% H3PO4溶液为流动相，经Sepex C18色谱柱分离，紫外检测器在360nm 处测定4 种黄酮类成分的含量。结果表明，不同产地的黄酮类成分含量存在一定的差异，云南产的苦荞麦中槲皮素、山奈酚的含量明显要高于其他地区，而不同地区样品中的芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷的含量相差不明显。张莉等[23]选用Wondasil C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为甲醇-0.4% H3PO4溶液（60∶40）；测定波长为370nm，HPLC 法测定了苦荞麦不同部位槲皮素的含量，得出同一品种苦荞不同植株部位的槲皮素含量为叶>茎>根。郑瑾等[24]在研究酸水解工艺条件对苦荞提取物中槲皮素含量影响时，采用HPLC 法测定提取物中芦丁和槲皮素的含量。测定方法学考察表明，芦丁和槲皮素的线性范围分别为0.093～291.2μg·mL-1、0.167～259μg·mL-1，精密度和重复性的RSD 均小于1.24%，方法的稳定性较好，并得出在最佳水解工艺条件下，苦荞醇提物中有64.11%的芦丁可转化为槲皮素，药代动力学表明，水解后的苷元槲皮素更易被肠道吸收。

对于含量较低的黄酮类化合物，仅用高效液相色谱法分析往往难以获得有效分离和准确定量，将色谱技术与质谱技术联用，可对目标组分进行有效识别，并可对物质结构进行解析。薛长晖[25]采用HPLC-UV/ESI-MS 技术对来自山西灵丘的苦荞粉中的黄酮类化合物进行了分离识别，共分离出5 种黄酮类化合物，并首次发现六取代黄酮和槲皮素-3-双鼠李糖苷是苦荞粉的重要组成。李欣等[26]建立了一种超高液相色谱-串联四极杆质谱法（UPLCMS-MS）对苦荞麦中芦丁、槲皮素和山奈酚含量进行测定的方法。结果表明，3 种黄酮组分的线性范围为0.1～100μg·mL-1，相关系数r2大于0.99，高、中、低三水平加标回收率均在94%以上，芦丁的最低检测水平为0.01ng·mL-1，其余两种物质为0.1ng·mL-1。此法具有预处理简单，分析耗时少，灵敏度高，选择性强等特点。

2.3 毛细管电泳法

毛细管电泳法是一种发展较为迅速的液相分离技术，具有试剂及进样量少，分离分析时间短，分辨率高，样品预处理方便，能满足目标化合物的快速微量分析要求。目前，报道的方法中，对苦荞中黄酮类化合物分离是通过选择合适的缓冲溶液和添加剂，让黄酮组分带电，在电场中实现高效分离。侯建霞等[27]建立了一种毛细管电泳结合电化学检测方法，可对苦荞麦芽中的表儿茶素、芦丁、槲皮素3 种黄酮类物质实现分离检测。在以50mmol·L-1的硼砂-硼酸缓冲液为运行液，pH 值为8.5，分离电压为20kV的条件下，3 种组分能在12min 内实现完全分离，加标回收率分别为100.6%、99.1%、101.1%。此法检出限较低，重现性好，有望应用于苦荞芽菜及苦荞产品中黄酮物质的快速分离检测。郭芳芳等[28]采用高效毛细管电泳法对5 个不同产地的苦荞中的黄酮组分进行测定，样品经超声波辅助醇提法提取后，离心分离，取上清液过滤分析，在最佳检测条件下，苦荞醇提液中4 种黄酮类化合物可在7min 内得到分离，方法的检出限较低，平均回收率为95.5%～104.7%，RSD 小于3.66%。毛细管电泳法目前应用于苦荞中黄酮物质的分析目前报道较少，未来有很大的发展空间。

3 结语

苦荞是提取天然活性成分黄酮类化合物的优质植物资源，近年来不断有新的提取方法被开发应用于苦荞中黄酮的提取，但这些方法得到的工艺参数目前尚限于小试规模，今后应加大工业化提取工艺参数的研究，规模化的提取设备也需同步研发。由于紫外分光光度法测定的是苦荞中的总黄酮的含量，随着苦荞中黄酮新类型的不断发现，对不同黄酮成分实行定性定量检测，就需进一步加强高效液相色谱法、毛细管电泳法、色谱-质谱检测法及联用检测技术的开发与应用。随着提取技术和检测技术的发展，苦荞黄酮在新的食品添加剂、保健品及药品中应用将更为广泛。