环状RNA在前列腺癌中的作用研究进展

陈振杰，王剑松，单怡倩，海东，丁明霞

1 昆明医科大学第二附属医院泌尿外科 云南省泌尿系统疾病临床医学中心，昆明 650101；2 广州市南沙区第六人民医院妇产科；3 景洪市人民医院泌尿外科

前列腺癌（PCa）是男性最常见的恶性肿瘤之一［1］。其早期症状不明显，出现症状时往往已进入中晚期，且目前针对中晚期PCa 的标准一线治疗——雄激素剥夺治疗的疗效极其有限，大多数患者在2～3年内发展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC），大大缩短了PCa 患者总体生存期［2］。因此，明确PCa 发生发展的分子机制对早期诊断、治疗和改善患者预后具有重要意义。研究表明，环状RNA（CircRNA）作为肿瘤诊断、治疗和预后分子标志物具有极大的应用前景。随着高通量测序和生物信息学技术的快速发展，已在多种生物体内成功鉴定出了大量高度保守且稳定表达的CircRNA，并逐渐揭示其生物学功能［3］。近年来CircRNA 在作为PCa 诊断、预后生物标志物以及治疗靶标方面的作用潜力引起了学者们的关注。现就CircRNA 在PCa 中的作用研究进展进行综述。

1 CircRNA在癌症中的作用

CircRNA 是一类由外显子或内含子反向剪接形成的闭合环状RNA，广泛存在于人体细胞中，在不同物种中具有高度保守性，但在不同组织、不同发育阶段和不同疾病中又具有其特异性。由于其独特的环形结构，缺乏5′末端帽子和3′末端poly A 尾，不易被核酸外切酶RNaseR降解，使得CircRNA 在作为新型临床标志物的开发应用上具有独特优势。此外，越来越多的证据表明，CircRNA 和mRNA、lncRNA一样，富含大量的微小RNA（miRNA）结合位点，可作为miRNA 海绵，通过吸附miRNA 或与RNA相关蛋白结合形成复合物，参与竞争性内源RNA（ceRNA）调控网络，调控下游靶基因的表达，进而参与调控包括癌症在内的人体各种疾病的发生和发展［2-4］。

近年来，大量研究表明CircRNA 在肺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、神经胶质细胞瘤、口腔癌、食管癌等多种临床常见肿瘤的发生发展过程中起重要作用［5］。有研究表明，Circ_100290 可发挥ceRNA 的作用，调节口腔癌的发生和进展［6］。ZHU 等［7］发现，Circ_0013958 在非小细胞肺癌的发生发展过程中起着miR-134 海绵的作用，参与调节细胞周期蛋白激酶CDK1的表达。ZHANG 等［8］研究证实，Circ_100269 在胃癌中可通过靶向miR-630 来抑制胃癌细胞的生长。同样，CircRNA 作为ceRNA在泌尿系肿瘤中的研究也取得了一定的进展。研究表明，在膀胱尿路上皮癌（UCB）细胞中表达上调的Circ_PRMT5 与UCB 患者的临床分期和生存率显著相关，且Circ_PRMT5 还可通过ceRNA 调控机制促进UCB 细胞的上皮间质转化（EMT）［9］。由此可见，CircRNA 作为ceRNA在肿瘤的发生和进展过程中起着至关重要的作用。

2 CircRNA在前列腺癌中的作用

尽管CircRNA 在PCa 中的研究开展较晚，但越来越多的研究证明了CircRNA 在PCa 中的重要作用。如近期DONG 等［10］表明，Circ_SMARCA5 在PCa中高度表达，且可通过促进PCa细胞的增殖、转移和糖酵解来促进PCa 的进展。LIU 等［11］则发现，在PCa中过表达的Circ_HIPK3 不仅促进了PCa 细胞增殖和细胞周期进展，而且显著抑制了PCa细胞的凋亡。由于CircRNA 所表现的ceRNA 特性，目前大部分学者热衷于研究CircRNA 与miRNA 之间的相互作用，来明确CircRNA在PCa中的分子机制。

2.1 CircRNA 作为ceRNA 调控前列腺癌进展 近年来，随着新一代测序技术的不断完善和应用，学者们在PCa 中筛选到了大量差异表达的CircRNA，并通过生物信息学分析和实验明确了其与miRNA 之间的密切关系。SHAN 等［4］在PCa 组织和细胞系中通过CircRNA 微阵列分析明确了Circ_FMN2 在PCa中表达上调，并通过功能实验证明其可充当miR-1238 的ceRNA 来上调LHX2的表达进而促进PCa 细胞的恶性生物学行为，且Circ_FMN2 的表达与PCa肿瘤的直径和TNM 分期呈正相关。HUANG 等［12］则发现，在PCa 中表达上调的Circ_ABCC4 可促进PCa细胞的增殖、细胞周期进程、体外迁移和侵袭等生物学行为，且Circ_ABCC4 的表达与PCa 患者预后差和TNM 分期显著相关。此外，SHI 等［13］发现，Circ_MBOAT2 在PCa 中的过表达不仅体外促进PCa细胞的增殖、迁移和侵袭，而且在体内促进PCa的增殖和转移。通过临床相关性分析进一步发现，Circ_MBOAT2的过表达与更高的Gleason评分、病理分期和预后不良有关。从机制上讲，Circ_MBOAT2通过充当miR-1271-5p的海绵来上调mTOR的表达，从而激活PI3K/Akt 途径，最终促进PCa 的进程。更重要的是，使用mTOR 抑制剂可显著抑制Circ_MBOAT2 介导的PCa 体内肿瘤生长。这揭示了针对CircRNA 信号通路开发PCa 新型生物标志物和治疗靶点的巨大潜力。随着研究的不断开展，越来越多的研究表明，不仅高表达的CircRNA 在PCa 中发挥生物学作用，PCa 中低表达的CircRNA 同样发挥着重要作用。例如，DONG 等［1］近期发现，虽然Circ_PSMC3在PCa中明显下调，但Circ_PSMC3在体外过表达后可抑制PCa 细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并参与调节细胞周期，且Circ_PSMC3 过表达有助于PCa细胞在G0/G1期停滞。更重要的是，他们通过临床相关性分析发现Circ_PSMC3 的低表达与PCa 患者的无进展生存期短显著相关。这表明尽管Circ_PSMC3 在PCa 中低表达，但却起着显著的抑癌作用，充当抑癌基因。同样，HU 等［14］发现，与非肿瘤组织相比，PCa 组织中的Circ_MTO1 表达显著下调，且Circ_MTO1 在肿瘤组织中的高表达与较低的TNM 分期相关。Circ_MTO1高表达的患者无进展生存期和总生存期更长，Circ_MTO1 高表达是无进展生存期和总生存期良好的独立预测因素。体外实验也证明，Circ_MTO1 抑制了PCa 细胞的增殖和侵袭，说明Circ_MTO1可能通过抑制癌细胞增殖或侵袭来延迟PCa 的进展，同样充当抑癌基因。此前已有几项研究证明了Circ_MTO1 在其他癌症中的抑癌作用。先前的一项体外研究报告显示，Circ_MTO1/miR-17/QKI-5 调节通路可抑制肺癌细胞的增殖［15］。另有研究表明，Circ_MTO1 在乳腺癌中抑制了癌细胞的活力并逆转了乳腺癌细胞对monastrol 的抗性［16］。至此，目前研究均提示高表达的CircRNA 在肿瘤中起癌基因作用，而低表达的CircRNA 则起抑癌基因作用，现实中是否存在与之相反的特例仍不得而知。

从机制上讲，大多数CircRNA 都是通过海绵化吸附作用抑制miRNA 来调节下游靶基因的表达进而发挥促癌或抑癌作用。而ZHENG等［17］研究证实，Circ_KATNAL1 在PCa 细胞中可直接与miR-145-3p结合，并调控下游Wnt1 诱导信号通路蛋白1（WISP1，也称为细胞通讯网络因子4）的表达。在他们研究中发现，虽然Circ_KATNAL1 也吸附miR-145-3p，但它可以进一步促进miR-145-3p 的表达并抑制下游靶基因WISP1 的表达。这表明Circ_KAT⁃NAL1 可以增强miR-145-3p 对靶基因表达的抑制作用，而不是解除其对靶基因表达的抑制作用。迄今为止，只有少部分研究发现了类似的情况。CHEN等［18］发现Circ_CSNK1G3 也可与miR-181 相互作用并增加miR-181 表达，然后抑制靶基因CBX7 的表达，从而促进PCa细胞的生长。此外，LI等［19］也发现Circ_ORC2 与miR-19a 结合并增强miR-19a 表达，然后抑制下游PTEN 表达以促进骨肉瘤细胞生长和侵袭。因此，通过海绵吸附miRNA 来增强miRNA 的功能似乎是CircRNA 新的调节机制，但需要更多的研究来证实。

2.2 CircRNA 与前列腺癌EMT EMT 在PCa 的进展和转移中起着至关重要的作用。KONG等［20］发现，在EMT期间诱导的雄激素反应型Circ_SMARCA5在PCa 中上调，并促进PCa 细胞的增殖。相反，Cir⁃cRNA 和miRNA 也是调节EMT 过程的细胞信号网络的重要组成部分。FENG 等［3］发现，在PCa 中高表达的Circ_0005276可通过与FUS结合蛋白相互作用激活XIAP的转录进而促进PCa细胞的增殖、迁移和EMT。同样，LI 等［21］报道称CircRNA-0016068 通过调节miR-330-3p/BMI-1 轴可促进PCa 细胞的生长、迁移和侵袭，并促进PCa细胞发生EMT。

YANG 等［22］近期研究结果显示，Circ_AMOTL1L在PCa中通过下调E-钙粘着蛋白和上调波形蛋白促进PCa 细胞的迁移和侵袭，并诱导EMT 和PCa 的进展。其中E-钙粘着蛋白是关键的上皮标记物，使细胞能够维持上皮表型和细胞间的黏附连接，而波形蛋白是细胞迁移所需的间充质标记。EMT 涉及E-钙粘着蛋白的下调以及波形蛋白的上调，从而导致细胞间黏附的减少和细胞迁移的增加。YANG等［22］在进行机制研究时发现，Circ_AMOTL1L 在PCa中通过海绵吸附miR-193a-5p 来解除miR-193a-5p对Pcdha 基因簇（钙粘着蛋白超家族成员之一）的抑制作用进而抑制PCa 的进展。且RBM25 可直接与Circ_AMOTL1L 结合并诱导其转录，而p53则可通过直接激活RBM25 基因来调节EMT 基因的表达。此前有研究表明，肿瘤抑制因子p53参与调节EMT，并在癌症转移中起关键作用［23］。然而，在PCa中，尚无关于p53 是否通过CircRNA 和miRNA 调节EMT 以及如何调节EMT 的相关研究。这些发现能够将p53/RBM25 介导的Circ_AMOTL1L/miR-193a-5p/Pcdha 调节轴与PCa 转移进展中的EMT 关联起来，从而为诱导EMT 的调节网络提供新的见解，为PCa的治疗策略提供新的思路。

此外，YAN 等［24］通过KEGG 分析发现了差异表达的CircRNA 和miRNA 均在EMT 相 关 的MAPK 信号通路上富集，hsa_circ_0001165 可通过hsa-miR-187-3p 调节TNF 表达并在PCa 细胞中诱导EMT，而hsa_circ_0001085 则可通过hsa-miR-196b-5p 和hasmiR-451a 间接调节TGF-β 信号通路、PI3K-Akt 信号通路和MAPK 信号通路，在EMT 诱导模型中对PCa细胞起调节作用。此前研究已经表明，TGF-β 可通过激活激酶依赖性信号传导通路促进EMT 进展，抑制TGF-β 受体可抑制肿瘤的侵袭和转移［25］。同时，PI3K/Akt 信号传导途径已被证明参与癌细胞中EMT 的诱导，激活的PI3K 产生第二个信使PIP3，该信使激活下游Akt，后者又通过磷酸化激活或抑制下游靶蛋白，这种级联反应可以调节细胞的存活、增殖和分化，并诱导EMT。因此，PI3K/Akt 信号通路的激活增加了肿瘤细胞的侵袭性和转移能力。此外，已有大量研究证实MAPK 信号通路在诱导PCa的EMT中的确切作用［26］，为YAN等［24］的研究提供了有力支持。

2.3 CircRNA 与前列腺癌放射抵抗性 放射抵抗是PCa治疗的一大障碍，其所涉及的机制异常复杂。不少研究已经报道了CircRNA 失调与癌症放射抵抗之间的联系。例如，Circ_PITX1 被沉默后可通过调节miR329-3p/NEK2轴来抑制糖酵解，从而提高神经胶质瘤细胞的放射敏感性［27］。研究表明，PCa中也存在类似现象。如DU等［28］研究发现，在PCa中异常上调的Circ_ZNF609 可通过加速糖酵解促进PCa 细胞的抗辐射能力，相反，体外沉默Circ_ZNF609 则增强了PCa细胞的放射敏感性并抑制了其糖酵解的代谢速率。此前JIN 等［29］已经证实，沉默Circ_ZNF609 可抑制PCa的生长、迁移和侵袭能力，DU等［28］的研究再次证实了这一点。 此后，又相继有研究证实Circ_ZNF609在鼻咽癌［30］和乳腺癌［31］中的促癌作用。

近期CAI 等［32］发现，Circ_CCNB2 在具有放疗抗性的PCa 组织和细胞模型中均上调，且Circ_CCNB2被敲低后可通过抑制自噬来恢复放射抵抗性PCa细胞对放疗治疗的敏感性。Circ_CCNB2 可直接抑制miR-30b-5p，而通过上调miR-30b-5p 可以抑制其靶基因KIF18A 的表达来逆转Circ_CCNB2 诱导的PCa放射抵抗性，恢复耐辐射PCa 细胞的放射敏感性。此前已有研究证明，KIF18A是促进肺腺癌细胞生长和转移的致癌基因［33］。在CAI 等［32］研究中，KIF18A同样发挥促癌作用。 且最终结果表明，敲低Circ_CCNB2 可以介导miR-30b-5p/KIF18A 轴的自噬抑制作用促进PCa 放射敏感性，说明Circ_CCNB2有可能预测PCa 放射抵抗的产生，并揭示了PCa 放射抵抗的分子机制。在治疗层面，敲低或通过某种方式抑制Circ_CCNB2 的表达可能有助于改善放射疗法对复发和转移PCa患者的治疗效果。

2.4 CircRNA 与前列腺癌耐药 众所周知，雄激素受体（AR）是驱动PCa 发生和进展的关键因素，即使在转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）患者中，AR的表达对于病情的进展也是必不可少的。 在mCRPC 中，AR 基因通常被大量转录，并产生大量雄激素受体剪接变体（AR-Vs）。目前研究表明有20多种AR-Vs，其中最受关注的亚型是AR-V7。大量证据表明，AR-V7 可通过组成型活性激活靶标启动子（不依赖于雄激素的结合）促进mCRPC对AR靶向药物（如恩杂鲁胺和阿比特龙）的耐药和疾病进展［34］。在最新的前列腺癌NCCN 临床实践指南中，已经考虑治疗mCRPC 时使用AR-V7 检测来指导阿比特龙和恩杂鲁胺的治疗选择［35］。

鉴于AR 和AR-Vs 在PCa 发展和耐药中的重要作用，近年来对于AR剪接而来的CircRNA以及其他与PCa 相关的CircRNA 是否在PCa 耐药中发挥作用也引起了学者们的关注。CAO 等［34］近期通过对47个mCRPC组织样本进行RNase R RNA 测序分析，发现了AR 的13个CircRNA 异构体——CircARs。他们发现在PCa的去势抵抗过程中，这些CircARs的表达显著上调，而且与mCRPC组织和异种移植瘤模型中线性AR 转录本（包括AR 和AR-Vs）的表达水平密切相关。在开展细胞实验过程中他们发现，应用雄激素可显著抑制CircARs 和线性AR 转录本的表达，而抗雄激素则可减弱这种抑制，这完全符合雄激素结合AR 后通过负反馈抑制AR 基因转录的作用机制，这可能提示CircARs 和线性AR 具有共同的转录调控机制，但其是否在PCa 耐药中发挥同样的生物学作用仍不得而知。

事实上，近年已有研究提示CircRNA 可能在PCa 耐药过程中发挥关键作用。如有研究发现hsa_circ_0004870在恩杂鲁胺耐药细胞中被下调，这可能就提示其在CRPC 的恩杂鲁胺耐药过程中发挥一定作用［36］。此外，XIANG 等［2］近期研究则发现CircRNA_UCK2 在恩杂鲁胺耐药的细胞中低表达，并最终通过一系列研究明确了Circ_UCK2 过表达后，可通过海绵吸附miR-767-5p 来调节TET1 蛋白的表达进而抑制恩杂鲁胺耐药细胞的生长和侵袭。尽管该研究并未明确恩杂鲁胺耐药细胞如何降低Circ_UCK2 的表达，但这些研究揭示了恩杂鲁胺耐药的新机制，也为预防PCa 患者发生恩杂鲁胺耐药和指导PCa治疗用药提供了新的思路。

2.5 外泌体CircRNA 与前列腺癌 研究表明，癌细胞产生的外泌体可直接促进肿瘤的侵袭、转移、耐药性和免疫逃逸［37］。近年有研究发现CircRNA 也可以通过外泌体分泌到细胞外并通过循环转运到机体各处调节细胞功能，并在肿瘤的发展中发挥重要作用。甚至，近期的两项研究表明，PCa中的CircRNA也可通过外泌体的分泌来发挥功能。LI等［38］收集PCa患者的外泌体用于人类CircRNA微阵列分析，筛选差异表达的CircRNA谱，结果发现共有35种显著高表达的Cir⁃cRNA，其中Circ_0044516 在PCa 患者血液外泌体和PCa 细胞的外泌体中均显著上调，且敲低Circ_0044516抑制了PCa细胞的增殖和转移。通过生物信息学和荧光素酶报告基因检测证实，Circ_0044516通过海绵吸附作用下调了PCa中miR-29a-3p的表达，进而调节PCa细胞的生物学功能。该研究既表明了外泌体Circ_0044516 在PCa 中的致癌作用，也初步证明了在外泌体中检测CircRNA 是切实可行的。此外，ZHENG 等［39］在PCa 细胞及其分泌的外泌体中均检测到了Circ_SLC19A1 的高表达，发现PCa 细胞可吸收高表达Circ_SLC19A1 的外泌体，并促进细胞增殖和侵袭。最终通过机制研究进一步证实，PCa 细胞可以通过分泌高表达Circ_SLC19A1 的外泌体来介导miR-497 调节SEPT2 的表达，从而影响下游ERK1/2 途径的激活并最终调节PCa 细胞的生长和侵袭。这两项研究不仅提示外泌体中的CircRNA 同样发挥生物学作用，而且提示通过外泌体检测Cir⁃cRNA也是切实可行的，为日后CircRNA的应用和检测提供了理论依据。

3 总结与展望

综上所述，CircRNA 不仅参与PCa 的发生发展，而且影响PCa 的治疗和预后，其所发挥的生物学作用贯彻PCa 的整个进展过程。鉴于CircRNA 独特的结构和生物学特性，其有望为PCa 新型生物标志物和治疗靶点的开发提供新的理论依据和思路。但目前CircRNA 在PCa 中的相关研究均处于基础研究阶段，其确切的临床应用价值和可行性仍有待开展大量的临床研究去证实。