肿瘤新生抗原通路相关标志物预测抗肿瘤免疫制剂疗效的研究进展

岳蒙丽，刘相良，马责竣，汤振东，纪伟，刘星雨，崔久嵬，李薇

吉林大学白求恩第一医院，长春130021

免疫检查点阻断剂的临床应用改变了恶性肿瘤的治疗格局，但临床上肿瘤患者对免疫检查点阻断剂的应答率并不让人满意。新生抗原的产生和呈递是产生免疫应答的关键，而DNA 损伤修复基因和抗原呈递基因的表达及结构的完整性则是新抗原产生和呈递的基础。DNA 损伤修复（DDR）包括DNA 直接修复、碱基切除修复（BER）和单链损伤修复（SS‑BR）、错配修复（MMR）等在内的多种修复过程。DDR 在维持基因组整体的完整性和稳定性中发挥重要作用。不同的DDR 通路相互交织以维持基因组的完整和稳定。DDR 基因突变会减弱机体抗DNA 损伤应答能力，造成基因复制错误累积，而肿瘤的发生是DNA 损伤对机体的远期效应之一。突变后未得到及时修复的基因经转录翻译合成新生抗原后，与HLA 分子结合，形成HLA-抗原肽复合物，提呈给T 细胞，使之活化、增殖，分化为效应T 细胞，引发抗肿瘤免疫反应［1］。

近年来，DDR 基因、抗原呈递基因和肿瘤免疫治疗获益间的关联逐渐被证实，其中免疫检查点阻断剂已在具有错配修复缺陷的肿瘤中取得显著效果［2］。DDR途径受损和随后的基因组不稳定性与致癌过程相关；同时，由于DNA 损伤累积和修复能力受损，这些突变的积累可致肿瘤新抗原的产生；成功呈递在肿瘤表面的新抗原能增强肿瘤细胞的免疫原性，改变肿瘤微环境中的免疫平衡，激活宿主抗肿瘤免疫反应，这类患者更有可能从免疫检查点阻断治疗中获益。DDR 基因和抗原呈递基因可作为有效的免疫治疗预测因子。目前，关于新生抗原相关标志物与肿瘤免疫治疗的研究较多。现对肿瘤新生抗原通路相关标志物预测抗肿瘤免疫制剂疗效的研究进展综述如下。

1 DDR基因相关标志物

DDR 基因参与人体DDR 机制，对各种原因引起的DNA 损伤进行修复，是一类基因的统称，包括POLE、TP53、MLH1、MLH2、MSH6、ATM、ATR等。

1.1 POLE DNA 聚合酶的校对是确保人类高保真度DNA 复制的关键因素之一。POLE 在前导链的校对过程中起核心作用，POLE 基因突变将会使校对功能受损，基因复制准确率降低，复制错误累积。POLE 突变常见于子宫内膜癌和肠癌，但在胃癌、胰腺癌、乳腺癌和脑肿瘤中较少见。已有研究显示，POLE 突变在结直肠癌（CRC）、非小细胞癌（NSCLC）及子宫内膜癌（EC）与肿瘤免疫治疗获益相关［3］。

POLE 基因突变携带者患结直肠癌的风险增加。CRC POLE 突变在早发性结直肠癌中发生的频率高，且肿瘤患者比其他类型的更年轻。POLE 突变与癌前病变、癌性病变中突出的肿瘤淋巴细胞浸润和克隆性新抗原负荷增强有关，PD-L1 基因水平表达明显升高，而识别由异常数量的突变产生的抗原性新表位是触发宿主细胞有效抗肿瘤免疫应答的关键步骤，因此POLE 突变的CRC 是免疫检查点抑制剂的良好候选者［4］。

POLE 突变是非小细胞癌中的罕见表型，2018年，已通过下一代测序评估了NSCLC 患者的突变频率。结果319例患者中有9例（2.8%）出现突变。在发生该基因突变的NSCLC 者中，TMB、PD-L1的表达和CD8+肿瘤浸润的淋巴细胞均较野生型高，表明POLE 突变是预测免疫治疗反应的候选生物标志物［5］。

散发性EC 癌前病变中可检查到POLE 突变，POLE 的体细胞突变是导致POLE 校对能力缺陷肿瘤发生的主要原因之一［3，6］。一方面POLE 突变的EC 患者对铂化疗耐药性增加；另一方面POLE 突变可能通过克隆新抗原表位富集，增强肿瘤免疫原性，使得肿瘤淋巴细胞浸润增加，显示出良好的预后和对免疫检查点阻断剂的良好反应。

1.2 TP53 TP53 蛋白是一种肿瘤抑制因子，通过阻止细胞周期为DDR 提供时间，同时TP53 直接参与BER 途径、MMR 途径等多种DNA 修复机制对由内外源性因素导致的DNA 损伤进行修复，在免疫调节和肿瘤的恶性转化过程中起重要作用［7］。

野生型和突变的TP53 与肿瘤免疫治疗存在多种联系。野生型TP53 可调节PD-L1 的表达。细胞中的微小RNA（miRNA）参与了细胞增殖、分化和凋亡等过程的调控。哺乳动物中的miR-34 家族由三个 成 员组成：miR-34a、miR-34b 和miR-34c，作为TP53 的下游因子，有助于TP53 发挥增殖抑制和诱导凋亡的作用［8］。野生型TP53 能与miR-34 的启动子结合，提高其表达，然后miR-34 通过与PD-L1 的3′UTR 结合有效下调PD-L1 mRNA［9］。突变的TP53虽然会导致其肿瘤抑制功能丧失，但突变的肿瘤细胞可能通过增强肿瘤细胞免疫原性，招募肿瘤微环境中的T 淋巴细胞，PD-L1 表达去抑制等途径增强免疫治疗效果。

在TP53 突变的非小细胞癌中，TP53 突变导致肿瘤基因组的不稳定性显著增强，从而可能通过产生肿瘤新抗原或导致癌基因（如KRAS）突变来增强肿瘤免疫原性；由于TP53 的缺失而导致的肿瘤免疫原性的增加亦可能导致细胞毒性T 淋巴细胞向肿瘤基质的募集增加，从而增强免疫检查点阻断剂的疗效；此外，不稳定的TP53 突变可导致未折叠的TP53 蛋白发生改变，亦可能独立构成增强T 细胞反应性的肿瘤特异性抗原；胰腺癌中TP53 突变亦可通过激活ARF6-AMAP1 通路，促进PD-L1 表达［10］。TP53 缺失导致肿瘤细胞中PD-L1 表达去抑制，可提高抗PD-1 和抗PD-L1 免疫检查点阻断剂的疗效已在部分胰腺癌、非小细胞癌、卵巢癌、乳腺癌患者中得到证实。因此，TP53 是对免疫检查点抑制剂治疗反应性的一个潜在预测因子。

1.3 dMMR 和MSI DNA 错配修复系统在识别和修复基因重组过程中或外部物理、化学损伤引起的碱基错配方面起关键作用，保证了基因组的完整性和稳定性。错配修复（MMR）蛋白如MLH1、MLH2、MSH6和PMS2在DNA修复途径中起重要作用［11］。

1.3.1 dMMR 如果错配修复途径中一个或多个蛋白质不表达或功能失调，这种状态被称为错配修复缺陷（dMMR）。目前，几种不同的方法被验证并用于检测MMR缺陷的癌症：微卫星序列的聚合酶链反应（PCR）扩增、免疫组织化学（IHC）染色测MMR蛋白、二代测序（NGS）。

MMR 基因突变已在多种实体肿瘤中被发现，包括大肠、子宫内膜、卵巢、胃、胰腺、输尿管和肾盂、脑（通常是胶质母细胞瘤）、小肠肿瘤，最常见于CRC和其他胃肠道恶性肿瘤、EC 和卵巢癌。由于其在基因组稳定性中的作用，MMR 缺乏导致体细胞突变的累积。MMR 缺陷肿瘤具有较高的体细胞突变负荷，细胞表面呈现多种新抗原，增强肿瘤免疫原性，极易受到免疫检查点抑制剂的影响。MMR 缺陷的肿瘤对免疫检查点阻断反应更强，特别是使用针对免疫检查点PD-L1 的药物，PD-1/PD-L1 检查点抑制剂在存在dMMR 的宫颈癌、CRC 和非结直肠恶性肿瘤等患者中可获得更高的疗效［12-13］。2017 年5 月，Key‑truda 获得FDA 批准用于治疗携带高度微卫星不稳定性（MSI-H）或dMMR 的实体瘤患者，而不受肿瘤位置和肿瘤类型的影响；2017 年8 月，FDA 基于Check Mate142 研究结果批准Opdivo 用于治疗MSIH 或dMMR 的成人和12 岁及以上儿童转移性结直肠癌（mCRC）患者；2018 年，FDA 批准首个mCRC 免疫组合疗法：Opdivo 联合Yervoy 用于治疗dMMR/MSI-H型的mCRC患者。

MMR 缺乏并不是肿瘤可快速产生新抗原的唯一机制，不能作为潜在的指标衡量免疫治疗敏感性，特别是在其作为次要致癌因素的组织中［14］。与BRCA 突变相反，MMR 缺乏是乳腺癌发病机制的罕见原因，但乳腺癌中BRCA 突变与高新抗原负荷及PD-L1 表达升高有关［15-16］。表明免疫治疗的现有生物标志物还存在不足。

1.3.2 MSI 微卫星是散布在整个基因组的编码区和非编码区重复的1～6 个碱基的短DNA 序列，特别容易出现复制错误。一般来说，这些误差可通过MMR 系统进行修正，以保持微卫星的稳定性；当MMR 系统由于遗传或表观遗传事件而缺陷时，导致DNA 复制错误的积累，这种现象被称为微卫星不稳定性（MSI）。

dMMR 和MSI 之间有很高的一致性，因此，在多数肿瘤类型中几乎可以互换使用；但在乳腺癌中不可互换，MMR 蛋白丢失是比MSI 更常见的事件，并且显示出肿瘤内的异质性，其他不能替换使用的肿瘤类型有待进一步研究确定［17］。复制错误的微卫星序列可能指导合成具有免疫原性的蛋白质，增加免疫细胞浸润，从而提高对免疫疗法的敏感性。MSIH肿瘤具有特征性的高度突变，多肽表达丰富，可作为新抗原引发快速免疫反应。由于不稳定和高度突变的性质，有些癌症表达高水平的检查点蛋白，包括PD-1和PD-L1，这使得MSI-H 肿瘤对用PD-L1/PD-1阻断药物的免疫疗法更敏感［18］。

单靠微卫星不稳定性可能不足以预测对免疫检查点抑制剂的反应。并不是所有的肿瘤新抗原能与主要组织相容性复合物MHCⅠ类分子结合，其他免疫调节机制亦可能起到促进免疫治疗效果的作用，如T 细胞缺失和遗传/表观遗传改变；在胃食管癌中的MSI 缺乏并不排除免疫治疗获益的可能性，而高微卫星不稳定肿瘤的原发性耐药仍存在于报告的病例中。

1.4 肿瘤突变负荷（TMB） TMB 是指肿瘤组织内所评估基因的外显子编码区每兆碱基中发生置换、插入、缺失和突变基因的总数。

肿瘤是由肿瘤细胞亚群构成的新生物，在空间和时间上均处于不断变化的状态，具有时空异质性，不同的突变过程可能在肿瘤发展的不同时期起作用。突变的DNA 可能被转录、翻译、加工，产生被免疫系统识别的新抗原，装载到主要组织相容性复合体分子上并呈现在细胞表面；虽然并非所有的突变都可产生新抗原，也并非所有呈递到细胞表面的新抗原都会被T 细胞识别，只有少数细胞表面的新抗原具有免疫原性；但肿瘤体细胞突变越多，具有免疫原性的新抗原形成的可能性就会越大。TMB 代表肿瘤抗原负荷量的估计值。据此可合理推断，DDR损伤与TMB呈正相关，具有高TMB肿瘤对免疫检查点阻断剂有更好的反应性。TMB 是一项独立于PDL1 之外的生物标志物，可与其他标志物联合使用，研究证实当TMB 和PD-L1 同时高表达时，免疫阻断治疗效果更好［19］。

TMB 预测免疫阻断治疗效果有一定限制性。肿瘤的时空异质性不仅影响编码突变，许多表观遗传机制，包括DNA 甲基化、染色质重塑和组蛋白翻译后修饰，都可以促进肿瘤克隆多样性。免疫原性新抗原并不是决定T细胞识别和杀伤肿瘤细胞能力的唯一因素，抗原呈递途径的突变亦会影响免疫阻断治疗的疗效，已知的有JAK1、JAK2、B2M 等免疫相关基因；非突变蛋白的融合和翻译后修饰产生的蛋白并不在TMB 的考虑范围，但仍然会导致新抗原的形成；还有部分突变会产生相对其他突变而言更高质量的新抗原，这些新抗原更容易被抗原提呈细胞摄取、加工、处理并提呈给T 细胞，更高效地诱导强大的抗肿瘤效应，如癌基因病毒开放阅读框产生的高质量抗原，这类突变的检测结果中，可能TMB并不是最高的，但免疫阻断治疗的效果却很好［20］。

准确的TMB 评估对于确保可靠和可重复地识别那些可能从免疫治疗中受益的患者至关重要。全外显子组测序是获得TMB 的金标准，但其成本较高，有针对性的二代测序可能更为可行。已有研究结果表明，基于NCC-GP150 panel 检测的血液肿瘤突变负荷可作为潜在的生物标志物，识别可能从抗PD-1/PD-L1 药物治疗获益的非小细胞癌患者［21］。在临床应用不同的NGS panel 评估TMB 的同时，诊断标准不一致的问题应被纳入考虑范围。

1.5 ATM、ATR 和WEE1 细胞内参与DNA 损伤信号传递的多个基因已在诸多研究中被确认。ATR-CHK1 和ATM-CHK2 是DNA 损伤修复的两个主要信号轴。ATM 主要传递DNA 双链损伤信号。在CRC、胃癌、肺腺癌、胰腺导管腺癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌和胆囊癌中均观察到ATM 突变；在胃癌、胰腺癌和乳腺癌中观察到不同比例的ATM低表达。表明ATM 通路可能有一定的抗癌屏障作用。ATM 和PD-L1 表达存在关联。骨肉瘤、肺癌、前列腺癌细胞体外培养实验证明癌细胞通过激活ATM、ATR、CHK1 等DNA 损伤信号传导途径相关分子上调PD-L1 表达［22］；胰腺肿瘤患者ATM 低表达与PD-L1 表达呈负相关，抑制ATM 会增加PDL1 表达，增加胰腺肿瘤对PD-L1 免疫阻断疗法的敏感性，但相关机制有待继续研究［23］。

ATR 可传递广泛的DNA 损伤信号，如DNA 复制叉停滞、链间交联、病毒感染和双链断裂。临床前细胞培养实验研究结果表明，抑制ATR 能下调PDL1 表达，以减弱PD-L1/PD-1 相互作用，增强癌细胞对T 细胞杀伤的敏感，这揭示了DNA 损伤修复和免疫检查点之间潜在联系，为ATR 抑制剂和免疫联合治疗提供了理论基础［24］。

WEE1 是CHK1 的下游效应器，参与调节细胞G2/M 期转换、组蛋白合成及DNA 损伤的修复，维持基因组稳定。WEE1 在多种癌症类型中高度表达，包括肝细胞癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、鳞状细胞癌、弥漫性桥脑胶质瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、白血病、黑色素瘤、卵巢癌；而在CRC、前列腺癌和NSCLC 中缺乏或下调。有癌细胞体外培养和小鼠模型试验证明抑制WEE1 激酶在体内会增强肿瘤对PD-L1 单抗免疫检查点阻断的敏感性，为临床抑制WEE1 激酶和激活抗肿瘤免疫的药物组合提供了思路［25］。

2 抗原呈递基因相关标志物

2.1 HLA 体细胞除了DDR 基因突变，导致基因组产生的错误不能被及时修复，产生新生抗原之外，还会发生HLA 基因突变，影响新抗原的呈递。HLA基因复合体包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类基因区，其中经典的Ⅰ、Ⅱ类基因具有抗原提呈功能；HLA 分子是存在于抗原呈递细胞表面负责抗原呈递的蛋白质分子。在细胞内合成后的新生抗原需与HLA 分子结合形成HLA-抗原肽复合物，呈递给T 细胞，才能引起抗肿瘤免疫反应。而肿瘤细胞可通过灭活HLA-抗原肽复合物破坏抗原提呈信号通路，导致T 细胞不能被激活并导致肿瘤免疫逃逸。

基因突变引起HLA 分子结构缺陷，正常HLA分子表达异常是不同来源的肿瘤中主要肿瘤逃逸机制。HLA 基因突变已在转移性黑色素瘤和晚期前列腺癌患者免疫治疗的耐药机制中得到证实［26-27］。除了经典的HLA 分子影响免疫治疗效果，非经典的HLA-I类分子如HLA-G抗原可通过抑制免疫活性细胞的功能在免疫耐受的建立和维持中发挥关键作用［28］，在某些恶性肿瘤中，如晚期多发性骨髓瘤，肿瘤细胞可通过过度表达HLA-G来逃避细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞介导的裂解，从而导致免疫逃逸的发生。

2.2 B2M HLA-Ⅰ类分子表达在所有有核细胞表面，由两条多肽链［α 链和β2-微球蛋白（B2M）］组成，主要识别和提呈内源性抗原肽，对HLA-Ⅰ类分子的正确折叠和转运到细胞表面很重要，肿瘤细胞可通过B2M 突变干扰HLA-Ⅰ类分子功能来抵抗肿瘤免疫治疗。B2M 突变导致HLA-Ⅰ类分子功能障碍，导致抗原提呈功能障碍，导致T 细胞杀伤活性减弱。研究表明，与接受PD-1阻断治疗的一组黑色素瘤患者中的应答者相比，无应答者B2M 位点杂合性丢失的发生率高出3倍［29］，提示B2M突变是原发性ICB耐药的机制。然而随着研究的深入，更多证据表明，包括黑色素瘤、大肠癌和肺癌在内的肿瘤在治疗过程中获得了B2M 突变，因此对PD-1/PDL-1 阻断有获得性耐药性［30-31］，表明对B2M 突变的肿瘤亚克隆的免疫编辑在肿瘤发展中已更早存在，在免疫检查点阻断剂的选择压力下可能成为主要的耐药机制，类似的结果在其他研究中也有证实。检测B2M在免疫治疗前和过程中表达的演变，对于T 细胞介导的癌症免疫治疗成功有重要意义。

2.3 其他 内源性抗原的提呈通路分子除了HLA、B2M 之外，还涉及低相对分子质量多肽、抗原加工相关转运物、内质网驻留的氨基肽酶等多种分子，然而对这些分子和免疫治疗疗效之间的关系研究甚少。

综上所述，DDR 基因和抗原呈递基因有可能影响宿主的免疫环境，增强对免疫检查点抑制剂的敏感性，改变恶性肿瘤的治疗格局，但这种相关联的细胞机制还知之甚少；将DDR 与变化的PD-L1 表达和免疫治疗反应联系起来的机制尚不明确；联合DNA损伤剂与免疫疗法治疗方案的毒性和免疫抑制作用尚未解决，许多DNA 双链损伤诱导药物与免疫检查点抑制剂的组合已进入各种疾病的临床试验评价，需样本数量更大的前瞻性研究进一步验证，助力肿瘤免疫治疗发挥更大作用。已发现的免疫逃逸途径关键分子或细胞有助于诱导持久的肿瘤排斥反应，HLA 的再表达已作为研究目标，但同时必须注意到，当前的研究简化了肿瘤微环境的复杂性。除此之外，肿瘤内异质性也是导致癌症致死、治疗失败和耐药性的关键因素。