血液细胞重编程为神经细胞的研究进展

翁晓滨，王跃嗣

滨州医学院，山东烟台264003

神经退行性疾病是由神经元和（或）其髓鞘的丧失所致，随着时间的推移而恶化并出现功能障碍，从而表现出一系列与神经退行相关的临床症状。神经退行性疾病是人口老龄化进程中必然出现的一类疾病，在其疾病过程中所伴随的病理变化是不可逆的，当前的治疗方法仍停留在通过药物控制其病情进展阶段。近年来，细胞替代疗法治疗神经退行性疾病展现出了巨大潜力。细胞替代疗法是指用功能正常的细胞替代体内的病变、损伤细胞，从而实现功能修复的治疗方法，其实质是直接将细胞作为药物，通过细胞移植的方法，用健康细胞替代病变细胞对各种疾病进行治疗的方法。随着体细胞重编程概念引入，细胞替代疗法中源头细胞的选择不断丰富。近年来，体细胞重编程为神经细胞用于神经退行性疾病治疗受到广泛关注，而供体细胞的选择仍然多以成纤维细胞为主，在成纤维细胞获取过程中必然产生一定程度损伤，对其扩增极易造成后代畸变，并且异体来源的成纤维细胞会引起免疫排斥反应。血液细胞作为临床诊断中常用的细胞来源，其采样方便，细胞活力好、创伤小，现已成为重编程的最佳来源细胞。血液细胞最初在神经细胞重编程领域的研究是采用新生儿脐血来源的CD34+细胞［1］。目前，已有多种血液细胞进行神经细胞重编程，如外周血单个核细胞（PBMC）、T 细胞、混合外周血细胞（PBC）等均可诱导为神经细胞。本文结合文献就血液细胞重编程为神经细胞的研究进展作一综述。

1 能够诱导为神经细胞的血液细胞

最初用于诱导神经细胞的血液细胞是新生儿脐血细胞（HUCB），因为HUCB中含有丰富的胎盘样干细胞和祖细胞，可快速高效地转化为神经细胞。随着研究不断深入，目前已有多种血液细胞可用于诱导神经细胞，如PBMC、T细胞、PBC等。

1.1 PBMC PBMC 是指外周血中具有单个细胞核的细胞，通常采用密度梯度离心法分离。以往供体细胞必须经过扩增传代来满足重编程所需要的细胞数量，这会让细胞具有谱系代数的异质性，而PBMC则避开了这一缺点，一次取材可获得大量细胞，使PBMC 成为更加优质的候选细胞。近年来，对于PBMC 诱导分化为神经细胞的研究相对较少，转化效率为0.6%～6%。2016 年，TANG 等［2］从一位33岁健康男性供血者中提取PBMC，利用非整合性附着载体来传递重编程基因（OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、c-Myc、KLF-4、SV40LT）去转染PBMC，结果发现采用PBMC 诱导的神经干细胞（HiNSC）具有强大的扩增能力，诱导7 周后成功分化为MAP2+神经元，并表达成熟神经元表面标志物NeuN。该研究成果为体细胞重编程为神经细胞扩展了供体细胞来源。YUAN 等［3］采用编码OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc的非整合仙台病毒载体转染PBMC，经过14～35 d诱导，出现了广泛的HiNSC 克隆；经过10 d 诱导成功定向分化为多巴胺能神经元，分化成熟的多巴胺能神经元不仅表达中脑腹侧神经元标志物和核受体相关因子，还具备电生理活性，通过细胞移植治疗帕金森病（PD）小鼠能够明显改善其临床症状。同样，ZHENG 等［4］采用编码OCT3/4、SOX2、KLF4、c-Myc的仙台病毒载体转染PBMC，经过2 个诱导阶段（约42 d），成功将PBMC 分化为中脑腹侧神经元，移植入PD 小鼠后能够明显改善其运动功能。这些研究为神经退行性疾病的治疗提供了依据。

采用PBMC 作为重编程的供体细胞，能够避开传统采用成纤维细胞作为重编程的供体细胞对人体本身的侵入性损害，如采用成纤维细胞需要开放性皮肤活检，而且在实验过程中，成纤维细胞需要不断传代以获得足够数量的实验细胞，在此过程中会引发基因突变的风险。但在对血液细胞重编程过程中，都使用了c-Myc这一原癌基因。OKITA等［5］研究表明，c-Myc 在血液细胞重编程过程中对诱导细胞衍生后代具有癌变风险。但目前尚无血液细胞所衍生的神经细胞在成瘤性方面的报道。因此，对于PBMC 重编程为神经细胞的风险仍需进一步探索，并且在实验过程中，重编程和神经元分化过程耗时久、效率低，仍有许多问题亟待解决。

1.2 T细胞 T细胞是一种终末分化的循环淋巴细胞。大多数研究认为，唯一有可能改变谱系特征的是未分化的干细胞和祖细胞，如成纤维细胞，而在终末分化的T 细胞上不会发生改变。TANABE 等［6］从1 名健康成人新鲜血液中分离出T 细胞作为起始细胞，使用游离载体编码BRN2、ASCL1、MYT1L、NGN2四个转录因子后进行重编程，成功诱导分化出成熟的神经元细胞。为了验证该方法的普遍适用性，他们又采集了35名不同年龄段、不同种族和性别的健康成人血液进行重编程，结果均诱导分化出成熟的神经元细胞。1 mL 外周血细胞在不需要初始扩增的情况下，一步就可以诱导产生5 万多个神经元细胞，其重编程效率达到6.2%。这些研究表明，细胞转分化能力并非仅限于未分化的祖细胞，终末分化的体细胞通过重编程亦可分化为谱系亲缘关系较远的体细胞，并能获得较高的转化效率［7-8］。T 细胞的重编程转化效率虽然比同类研究较高，但与成纤维细胞相比，其转化效率仍然较低。

1.3 PBC PBC 是血液细胞诱导为神经细胞的常规来源细胞，除了正常人的PBC 可作为重编程的候选细胞外，阿尔茨海默病、PD 患者的PBC 亦可定向诱导分化为神经细胞。研究表明，PBC 相较于其他血液细胞，可快速稳定地向神经细胞转化。2018 年SHENG 等［9］以仙台病毒作为载体，非整合SOX2、c-Myc 两个基因，在培养过程中添加小分子GSK3β抑制剂、Hedgehog 活化剂、ALK-5 抑制剂、重组人白血病抑制因子和苯环丙胺，在7 d 内就可将PBC 转化为HiNSC，转化效率为0.08%～0.66%，继续诱导分化6 周后，PBC 来源的HiNSC 分化为成熟的神经元细胞。该研究还发现，直接转诱导的HiNSC 在很大程度上丧失了其亲代PBC 的年龄相关性DNA 甲基化模式，其新生成的HiNSC 更年轻化。有研究认为，多能性因子OCT4 会引起遗传畸变和染色体不稳定［10］。本研究在未使用OCT4 的情况下，诱导分化形成的HiNSC 具备新生成细胞的谱系特征，在神经退行性疾病治疗上更具有临床价值。

1.4 HUCB HUCB 是新生儿娩出后，残留在胎盘和脐带中的血液。脐血来源的细胞是最具年轻化的细胞，免疫原性较弱，是细胞生物治疗、组织工程学等潜在的候选细胞。有研究报道，脐血中含有胚胎样干细胞和祖细胞，能够在培养过程中迅速高效地增殖，对其定向培养和诱导可分化为神经元细胞、神经胶质细胞［11］。WALCZAK 等［12］成功将脐血来源的细胞定向分化为神经元细胞，并将分化的神经元细胞移植入小鼠纹状体中，免疫组化显示移植后脐血来源的神经元细胞能够在小鼠脑内存活并表达早期神经元标志物。HUCB 因其自身的突出特征，其在神经退行性疾病的生物学治疗中显示出强大的临床应用前景。

2 血液细胞作为供体细胞诱导为神经细胞的技术困难

现阶段，血液细胞向神经细胞转化的研究相对较少，仍面临许多亟待解决的技术困难，如转染多个转录因子的异质性、血液细胞重编程效率低等。

2.1 转染多个转录因子的异质性 在重编程过程中，部分供体细胞不能同时转染到几个甚至十几个转录因子，这部分供体细胞不能转变为神经细胞，也不同于供体细胞，即在重编程过程中产生了异质性。目前，多数研究产生的特定神经元类型多为混合型或其他非典型的细胞类型［13］。如在产生特定多巴胺能神经元的研究中，这种异质性使得体外模型建立以及体内追踪多巴胺能神经元变得困难。有研究试图将诱导得到的多巴胺能神经元进行纯化，培养25 d时纯化的Th 阳性细胞仅达到70%［14］。此外，异质性可引起移植后宿主体内肿瘤形成、异动症等其他未知风险的发生，给患者带来了潜在的、不可预估的安全风险［15］。现阶段针对特定神经细胞的优化方案并不十分完美，均无法回避血液细胞重编程为特定神经细胞时的异质性问题。

2.2 血液细胞重编程效率低 相较于重编程转化种子细胞的成纤维细胞，血液细胞的诱导分化效率低这一技术难题一直未被突破，这也限制了血液细胞重编程为神经细胞的临床应用［16］。学者们通过多种方法来提高重编程效率，如有研究发现分化潜能高的造血祖细胞重编程效率高于终末分化的T细胞和B 细胞，表明细胞的分化状态可能对血液细胞的重编程效率有一定影响［17-18］。细胞的表观遗传学不管是在干细胞还是在体细胞均普遍存在，表观遗传因子的靶点是某一功能的一群基因，而不是某一个基因，实现靶向性必须依赖其他因子的共同作用。有研究报道，转录因子的基因沉默能够抑制某些表观遗传学作用［19］。因此，对这些机制进行干扰有可能会提高血液细胞的重编程效率。

3 转录因子在血液细胞重编程为神经细胞过程中的作用

3.1 SOX2 在血液细胞重编程为神经细胞中的作用 SOX2 基因定位于人染色体3q26.3-27，其编码的SOX2 蛋 白由317 个氨基酸组成［20］。AVILION等［21］研究发现，SOX2 蛋白能够在神经外胚层的HiNSC 中特异性表达，对维持胚胎干细胞的自我更新和干性具有关键的调节作用。ELLIS 等［22］通过绿色荧光蛋白标记SOX2 构建转基因小鼠模型，证实SOX2不仅表达于胚胎神经祖细胞，还可表达于成体中枢神经系统的增殖细胞以及一些神经组织，如侧脑室下区、海马齿状回的颗粒下层等。因此，在血液细胞重编程为神经细胞过程中，研究者们常常加入SOX2以加速重编程进程。

3.2 OCT4 在血液细胞重编程为神经细胞中的作用 OCT4 属于POU 转录因子家族成员之一，能够激活或抑制多种靶基因表达，是维持胚胎干细胞多能性的关键基因［23］。最新的研究发现，OCT4 与SOX2 特异性结合可加速血液细胞重编程进程［24］。因此，OCT4在血液细胞重编程为神经细胞中的作用逐渐受到重视。

3.3 ASCL1 在血液细胞重编程为神经细胞中的作用 ASCL1是碱性螺旋—环—螺旋转录因子家族的重要成员，能够促进高分化潜能细胞向神经元细胞分化［25］，在周围神经系统和中枢神经系统的发育过程中不可或缺。研究表明，ASCL1 对中枢神经系统中特定神经细胞的增殖具有调节作用，能够决定特定神经细胞中哪些DNA 序列被开启或关闭，从而决定这些细胞的形成和功能。

4 血液细胞重编程为神经细胞的临床应用前景

神经系统是人体内起主导作用的功能调节系统。神经系统发生病变后，病变的神经细胞不能进行有效地再生与修复，故神经系统疾病的致死率和致残率一直高居榜首。随着人口老龄化程度加深，神经退行性疾病在老年人群中的患病率明显上升，但当前的医疗手段仍停留在控制疾病进展阶段。因此，替换或修复损伤和缺失的神经细胞成为学者们着力攻克的难题。利用干细胞重编程分化为神经细胞已成为治疗神经退行性疾病的研究热点。学者们通过构建神经系统疾病动物模型，在体外通过相关手段将不同来源细胞重编程为特定的神经细胞，再移植入体内，从而治疗神经系统疾病。血液细胞作为临床诊断中常用的细胞来源，其采样方便，细胞活力好、创伤小，现已成为重编程的最佳来源细胞，在神经退行性疾病的治疗中具有更广阔的临床应用前景。

综上所述，血液细胞重编程为神经细胞将为神经退行性疾病的治疗提供了一条新的途径，相较于其他来源类型的细胞，血液细胞采样方便，细胞活力好、创伤小，是细胞重编程的最佳来源细胞。但血液细胞重编程过程中也存在一系列技术难题，如转染多个转录因子的异质性、血液细胞重编程效率低等。如能解决这些技术难题，血液细胞重编程为神经细胞在神经退行性疾病治疗中的应用前景将更加广阔。