胰腺癌PDX模型研究进展

卢彧，任学晨，周成亮，陈昊，康迎新，樊勇，康博雄，刘永永，王琛

兰州大学第二医院，兰州730030

近年来，胰腺癌的发病率和死亡率在世界范围内呈明显上升趋势。据统计，我国胰腺癌的死亡率在所有恶性肿瘤中居第六位［1］。虽然胰腺癌的治疗取得了很大进展，但在消化系统肿瘤中其总体生存率仍然较低［2］。胰腺癌预后不良与其基因组的复杂性、异质性以及难以早期诊断和缺乏有效治疗方案等有关。因此，深入研究胰腺癌发生、发展的分子生物学机制，对提高其诊疗水平具有重要意义。目前，对胰腺癌的研究依赖高拟合度的临床前模型，如细胞系移植模型、基因工程动物模型、类器官模型等。但这些模型并不能准确反映胰腺癌的形态学、病理学以及增殖、侵袭等生物学行为，更不能模拟胰腺癌的基因组特征。近年通过活组织检查或手术切除获得的人类肿瘤组织，可直接植入免疫缺陷啮齿类动物体内而产生人源肿瘤异种移植（PDX）模型。PDX模型有可能成为胰腺癌临床前研究和药物筛选的首选模型。本文结合文献就胰腺癌PDX 模型的研究进展作一综述。

1 胰腺癌PDX模型制备

1.1 胰腺癌PDX 模型制备方法 胰腺癌PDX 模型的制作过程［3］：通过手术或组织活检获取原发性或转移性胰腺癌组织片段，即刻冷冻保存；移植前将胰腺癌组织分割成1～4 mm3碎片，嵌入少量基质胶后植入免疫缺陷小鼠的原位或皮下。基质胶是一种可溶性的类基底膜基质，可为胰腺癌细胞在接受宿主营养供给之前提供充足的生长条件。因此，裹有基质胶的肿瘤细胞比单纯的肿瘤细胞更易种植且更快成瘤。在第一代免疫缺陷小鼠体内建立的PDX 组织被切成片段，一部分重新植入新的宿主中，以供下一代使用；一部分冷冻保存，后期验证传代肿瘤在形态学和遗传学上的保守性。胰腺癌PDX 模型制备成功率为40%～80%［4-8］。从胰腺癌组织接种至收获一般需要2～4 个月，超过6 个月仍未发现明显的肿瘤组织即认为植入失败［4］。皮下种植的肿瘤可通过触诊测量，原位或转移部位的肿瘤可通过影像学监测［5］。研究一般从第3 代（F3）PDX 开始，多数采用F3～F10 PDX 进行实验［6］。不同胰腺癌患者PDX 移植的成功率不同。有研究认为，PDX 移植成功率与胰腺癌肿瘤大小、恶性程度、淋巴结转移或远处转移、血管侵犯以及是否经过化疗等因素有关［4-8］。

1.2 制备胰腺癌PDX 模型的小鼠品系 制备胰腺癌PDX 模型可使用胸腺缺失裸鼠、严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠、非肥胖糖尿病（NOD）/SCID 小鼠、NOD/SCID/IL-2 受体γ 缺失（NSG）小鼠等。这些品系的小鼠在免疫抑制和研究效益方面存在差异。胸腺缺失的裸鼠成本最低，但因其具有固有免疫应答系统，存在较强烈的宿主抗移植物反应，其制备胰腺癌PDX 模型的成功率较低。SCID 小鼠先天性无T、B 淋巴细胞的发育和成熟，获得性免疫缺失，但仍具有正常的NK 细胞、巨噬细胞和粒细胞，仍可发挥固有免疫功能。NOD/SCID 小鼠较SCID 小鼠具有更低的NK 细胞活性，宿主抗移植物反应发生率更低。NSG 小鼠敲除了IL-2 受体的γ 链，是目前免疫缺陷程度最高的工具小鼠，最适合构建加入人体免疫系统的PDX 模型。如今的PDX 模型多是通过将获取的患者肿瘤组织移植入免疫缺陷小鼠（通常是NOD/SCID小鼠或NSG小鼠）构建的［4-8］。

2 胰腺癌PDX模型与传统肿瘤模型比较

胰腺癌基础研究的临床转化进展较慢，一个潜在的因素是研究胰腺癌的动物模型不可靠。传统的胰腺癌临床前模型主要有细胞系移植模型和基因工程动物模型，相较于胰腺癌PDX 模型，其对人类胰腺癌基因组和肿瘤微环境特征的模拟程度明显不足。

2.1 细胞系移植模型与胰腺癌PDX 模型比较 首个人类胰腺癌细胞系是在1963 年完成的［9］，之后的细胞系大多是从小鼠或人的肿瘤细胞中发展而来。使用细胞系进行研究有许多优点，如易操作、成本低、可重复性高以及能够进行遗传改变和药物干预等。然而细胞系及其小鼠移植物在胰腺癌的研究中存在一定局限性。第一，许多细胞系是从侵袭性、转移性肿瘤组织中产生的，通常无法代表原发肿瘤的初期状态和病变特征。第二，细胞系缺乏其他类型细胞，如成纤维细胞、神经纤维、免疫细胞、脂肪细胞、内皮细胞等，无法展示在临床上肿瘤复杂的异质性［10］；而且细胞系中存在几种不同的亚群，在传代过程中可能会选择更具侵袭性的克隆［11］，无法保证研究对象的同质性。第三，细胞系的反复传代会发生各种外源性遗传物质污染，或由于优势细胞的遗传漂变、自发或被动的拷贝数变异、点突变等，不可避免地导致细胞系的遗传学改变［12］。实体肿瘤的组织学特征，如肿瘤血管的异常结构、功能及致密的细胞外基质等，是药物输送的障碍，而胰腺癌PDX 模型具有与原发肿瘤相似的促结缔组织增生性反应和血管分布特征［13］。因此，胰腺癌PDX 模型比细胞系移植模型更能准确地模拟人体内的药物传递状态。

2.2 基因工程动物模型与胰腺癌PDX 模型比较 基因工程动物模型是由引入小鼠基因组的特定突变引起的，而人类胰腺癌是由多种遗传改变引起的。因此，基因工程动物模型的主要缺点是可能会丢失人类肿瘤的基因组特征，同时引入新的未知突变，并且难以鉴定小鼠肿瘤与人类肿瘤的同源程度［14］。此外，基因工程动物模型制备昂贵且耗时，效率相对低下［14］。不同于基因工程动物模型，胰腺癌PDX 模型能够反映真实的遗传特征，避免了研究靶点以外的遗传改变。同时，胰腺癌PDX 模型可直接在普通的SPF 动物实验室制备，大大节省了时间和经费，肿瘤组织来源也相对容易，一旦种植成功，可以在几次冻融循环和传代后反复使用。

3 胰腺癌PDX 模型在临床前和临床试验中的应用

目前，在临床前和临床试验中，胰腺癌PDX 模型在识别肿瘤标志物、临床前药物评价、临床精准化疗、胰腺癌转移及神经浸润等研究中广泛应用。

3.1 识别肿瘤标志物 肿瘤标志物是指特征性存在于恶性肿瘤细胞，或由恶性肿瘤细胞异常产生的物质，或是宿主对肿瘤的刺激反应而产生的物质。肿瘤标志物能够反映恶性肿瘤的发生、发展，在恶性肿瘤诊断、预后判断、治疗反应监测、复发风险评估和靶向药物研发等方面具有重要作用。目前，胰腺癌的通用肿瘤标志物仅有CA19-9［15］。许多研究使用PDX 模型开发更可靠的胰腺癌生物标志物。GARRIDO-LAGUNA 等［16］通过PDX 测序发现，移植成功率高的PDX 多为SMAD4 基因的突变体，并具有转移性的基因表达特征和较差的预后。JIMENO等［17］通过PDX 确定PLK1 能够反映胰腺癌吉西他滨化疗的敏感程度，PLK1高表达预示胰腺癌对吉西他滨的耐药性增加。DUTTA 等［18］利用PDX 模型跟踪体内丙酮酸的代谢过程，结果发现在生长较快的PDX模型中丙酮酸还原为乳酸的转化率较高。

3.2 临床前药物评价 在PDX 模型中进行药物试验，胰腺癌患者的肿瘤标本可以种植到多个动物体内，能够在同一肿瘤中进行干预组和对照组的直接比较。基于这种优势，PDX 模型已被用于测试药物疗效的研究。RUBIO-VIQUEIRA 等［3］率先使用胰腺癌手术标本的PDX 构建了一个临床前药物研发平台，该平台能够用于预测抗肿瘤药物的敏感性。KAWAGUCHI 等［19］构建了对吉西他滨化疗耐药的原位胰腺癌PDX模型，并测试了10种药物的化疗效果，结果发现只有考比替尼和曲美替尼能够抑制胰腺癌生长，从而证实了原位PDX 模型用于胰腺癌个体化治疗的潜力。

PDX 模型还能够更清楚地反映化疗药物的作用机制。RICCIARDIELLO 等［20］将胰腺癌PDX 模型根据对吉西他滨是否耐药进行分组，并对两组mRNA 表达谱进行比较，结果发现PGM3 在耐药PDX 模型中高表达，表明吉西他滨和PGM3 抑制剂FR054 联用能够达到更好的抗胰腺癌效果。此外，PDX 模型还被用于研发针对胰腺癌的免疫疗法。MA 等［21］在胰腺癌PDX 模型中使用抗PD-1 抑制剂和抗OX40 激动剂组合，结果发现二者联合能够增加胰腺癌中记忆CD4+和CD8+T 细胞数量，从而消灭了所有可检测到的肿瘤细胞。

3.3 临床精准化疗 基于前述PDX 模型的优势，这种模型可为特定肿瘤类型设计治疗方案。有研究报道，1 例吉西他滨化疗耐药患者的PDX 模型对丝裂霉素C 敏感，该患者接受丝裂霉素C 化疗后保持了3年无病生存状态［22］。胰腺癌PDX 模型作为高通量药物筛选平台可用于开发有效的治疗方案。WITKIEWICZ 等［23］使用胰腺癌PDX 模型进行高通量药物筛选，测试超过500 种单一药物和联合药物方案，发现了针对胰腺癌的多种个体化治疗方案。

3.4 其他应用 胰腺癌PDX 可用于制备胰腺癌转移和神经浸润模型。TANAKA 等［24］使用冷冻保存的胰腺癌患者肿瘤组织构建了胰腺癌肝转移PDX模型，结果发现种植成功率与冷冻时间和Ki-67 指数有关，这为研究胰腺癌转移机制开拓了新的方向。

神经浸润是导致胰腺癌预后不良的重要因素。胰腺的自主神经在胰腺癌发生、发展过程中发生了显著的病理变化，其具体机制尚不清楚。PDX 模型能够很好地解决上述难题［25］。但目前未见胰腺癌神经浸润PDX 模型的报道，主要是因为构建胰腺癌原位种植合并神经浸润模型的难度巨大，同时无法准确辨认合格的神经浸润模型。

4 胰腺癌PDX模型的不足与改进

PDX 模型在胰腺癌基础和临床研究中具有重要的应用价值。但胰腺癌PDX 模型耗时长，可能需要几个月才能完成，仍未体现出在疾病进展前短时间内指导胰腺癌患者个体化治疗的应用价值，今后还需要将PDX 模型的生成时间合理优化。此外，随着肿瘤细胞的传代培养，与肿瘤相关的基质细胞逐渐被小鼠基质细胞取代［26］。今后，胰腺癌PDX 模型的改进方向包括PDX 的三维类器官模型，这种模型可进一步表征胰腺癌的三维结构和极性，能够保持原有的肿瘤微环境［14］。另外，免疫细胞移植也可能是改善胰腺癌PDX 模型的方向，通过给免疫抑制小鼠过继人类造血干细胞来建立人类免疫系统，能够更有效地研究免疫系统在胰腺癌侵袭、转移和复发中的作用机制［27］。

总之，胰腺癌PDX 模型能够最大程度保留肿瘤的生物学特征，是胰腺癌临床前研究和药物筛选的首选模型，已经在识别肿瘤标志物、临床前药物评价、临床精准化疗、胰腺癌转移及神经浸润等研究中得到广泛应用。未来还需要将PDX 模型进行合理优化，进一步提高其代表原发肿瘤特征的潜力，使之成为改善胰腺癌患者预后的最佳临床前工具。