lncRNA PVT1 对前列腺癌细胞增殖及侵袭、迁移的影响

张建伟，王华东，郭宝印，李海波，孙凤亮

天津市宝坻区人民医院，天津301800

前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一。随着我国人口老龄化加剧，前列腺癌的发病率不断上升，已成为我国男性第五大常见恶性肿瘤［1］。有研究报道，晚期前列腺癌治疗后易出现复发或转移，这是导致患者生存期较短的主要原因［2］。但目前前列腺癌复发或转移的分子机制尚不完全清楚。近年研究发现，长链非编码RNA（lncRNA）可作为致癌基因或抑癌基因参与人类多种肿瘤的发生、发展［3］。人浆细胞瘤转化迁移基因1（PVT1）是lncRNA家族成员之一，基因定位于人染色体8q24.21 上，可参与染色质修饰、蛋白质活性调节等生物学过程，与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移密切相关［4-5］。有研究报道，lncRNA PVT1能够通过多种途径参与肿瘤恶性进展，并与肿瘤术后复发和转移有关［5-6］。但目前lncRNA PVT1与前列腺癌关系的报道较少。2018年6月—2020年1月，本研究观察了lncRNA PVT1对前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人前列腺癌细胞DU145、人正常前列腺上皮细胞RWPE-1，购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。lncRNA PVT1敲低质粒（lncRNA PVT1 siRNA）、阴性对照质粒（Negative Control siRNA），由湖南丰晖生物科技有限公司设计合成。紫外分光光度计和多功能酶标仪，购自美国赛默飞公司；CFX96 Touch 实时荧光定量PCR 仪，购自美国Bio-Rad 公司；AlphaImager HP 凝胶成像系统，购自美国ProteinSimple 公司。G418，购自美国Amresco 公司。PrimeScript Reverse Transcriptase，购自瑞士Roche公司；SYBR Green Ⅰ核酸染料，购自北京索莱宝科技有限公司。PVT1、β-actin 一抗以及辣根过氧化物酶标记的IgG二抗，购自美国CST公司。

1.2 细胞传代培养 将DU145 细胞接种于RPMI 1640 培养基，RWPE-1 细胞接种于含5 ng/mL 人重组表皮生长因子的角质形成细胞无血清培养基，然后置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养，并根据培养基pH 变化更换新的培养基。当细胞生长融合80%左右时，用含0.25% EDTA 的胰蛋白酶消化处理后，按1∶4传代。

1.3 lncRNA PVT1 mRNA表达检测 采用RT-qPCR法。取传3 代、对数生长期的DU145、RWPE-1 细胞各1×107个，采用TRIzol 法提取细胞总RNA，经紫外分光光度计鉴定，提取的总RNA 纯度和浓度合格，可用于后续实验。按PrimeScript Reverse Tran⁃scriptase 说明将总RNA 逆转录为cDNA。逆转录条件：40 ℃40 min，30 ℃10 min。以cDNA 为模板，按SYBR Green Ⅰ说明进行PCR 扩增。引物序列：lncRNA PVT1 上游引物5"-TAGGGTACGCTGCCG⁃TATGCT-3"，下游引物5"-CCGTACGTAGCCGTAT⁃GAGCT-3"；U6 上游引物 5"-CCTAAGTCCCGT⁃CAGTCGTGA-3"，下游引物 5"-GCTAGCGCCTC⁃CAGCTGTCG-3"。PCR 反应体系共25 μL：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，cDNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL；反应条件：95 ℃20 s，95 ℃10 s、60 ℃20 s 共40 个循环，最后75 ℃10 s。以U6 为内参，采用2-ΔΔCT法 计 算lncRNA PVT1 mRNA相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.4 细胞转染与稳转细胞筛选 取传3 代、对数生长期DU145 细胞，以3.5×105个/孔接种于含RPMI 1640 培养基的6 孔板，然后置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。培养24 h，随机将细胞分为观察组和对照组，按Lipofectamine2000说明，分别转染lncRNA PVT1 siRNA和Negative Control siRNA，然后置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱。转染48 h，加入适量G418，使其终浓度分别为0、200、400、800、1 000 mg/L，每3～4 天更换1 次筛选培养基。培养10～14 d，以细胞全部死亡的最低浓度为G418最佳筛选浓度。以G418最佳筛选浓度的一半维持培养转染后的细胞，直至获得稳转细胞株，分别检测lncRNA PVT1 mRNA和蛋白表达。

lncRNA PVT1 mRNA 表达检测采用RT-qPCR法，检测步骤同1.3。

lncRNA PVT1蛋白表达检测采用Western blotting法。收集上述稳转细胞，加入适量细胞裂解液充分裂解，提取细胞总蛋白，经BCA 法蛋白定量合格。然后加入等体积的上样缓冲液，煮沸变性。取变性蛋白30 μg，SDS-PAGE（5%浓缩胶、10%分离胶）分离蛋白。采用湿转法将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上，然后用5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入PVT1、β-actin 一抗（稀释比均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜。次日，吸弃一抗，TBST冲洗，加入辣根过氧化物酶标记的IgG 二抗（稀释比为1∶4 000），室温孵育1 h。ECL 发光，在AlphaImager HP 凝胶成像系统中自动曝光。以β-actin 为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.5 细胞增殖活性检测 采用MTT法。收集上述稳转细胞，用完全培养基重悬制成密度为1×104个/mL的细胞悬液，取细胞悬液200 μL 接种于96 孔板，然后置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱。分别于培养12、24、36、48、60、72 h，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，室温孵育4 h；弃上清液，加入DMSO 150 μL，充分混匀。酶标仪于570 nm 波长处检测各孔的光密度（OD）值。以OD570值代表细胞增殖活性。每个时间点设6个平行孔。实验重复3次，取平均值。

1.6 细胞侵袭能力检测 采用Transwell 小室实验。收集上述稳转细胞，用无血清的培养基制成密度为2.5×104个/mL的细胞悬液。取细胞悬液500 μL加入Transwell 小室上室，下室加入600 μL 含10%FBS 的RPMI 1640 培养基。然后将Transwell 小室置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养24 h。取出Transwell 小室，用棉签拭去未穿膜细胞，经多聚甲醇固定和结晶紫染色，倒置相差显微镜下拍照观察。随机选取5个200倍不重叠视野，计数穿膜细胞数。以穿膜细胞数表示细胞侵袭能力。实验重复3次，取平均值。

1.7 细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验。收集上述稳转细胞，用完全培养基重悬，制成密度为2×106个/mL 的细胞悬液，取细胞悬液2 mL 接种于6孔板，然后置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。当细胞生长融合70%左右时，用10 μL 移液器吸头垂直于孔底划5 条平行划痕，PBS 冲洗去除悬浮细胞，显微镜下拍照观察并记录划痕距离（即0 h 划痕距离）。吸弃原培养基，加入含10% FBS 的RPMI 1640 培养基继续培养24 h，显微镜下拍照观察并记录划痕距离（即24 h 划痕距离），计算细胞迁移率。细胞迁移率=（0 h划痕距离-24 h划痕距离）/0 h划痕距离×100%。每组设3 个复孔，实验重复3 次，取平均值。

1.8 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。计量资料以±s表示，两样本均数比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DU145、RWPE-1 细胞lncRNA PVT1 mRNA 表达比较 DU145、RWPE-1 细胞lncRNA PVT1 mRNA相 对 表 达 量 分 别 为3.41 ± 0.81、1.00 ± 0.21，DU145细胞lncRNA PVT1 mRNA相对表达量明显高于RWPE-1细胞（t=7.938，P＜0.01）。

2.2 两组lncRNA PVT1 表达比较 观察组与对照组lncRNA PVT1 mRNA 相对表达量分别1.35 ±0.31、3.14±0.47，lncRNA PVT1蛋白相对表达量分别 为0.24 ± 0.04、0.88 ± 0.05。观 察 组lncRNA PVT1 mRNA 和蛋白相对表达量均低于对照组（t分别为5.053、18.110，P均＜0.01）。

2.3 两组细胞增殖活性比较 观察组培养60、72 h时细胞增殖活性均低于对照组同期（P均＜0.01），而两组培养12、24、36、48 h 时细胞增殖活性比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 两组培养不同时间细胞增殖活性比较（±s）

注：与对照组同时间比较，*P＜0.01。

组别对照组观察组细胞增殖活性培养72 h 0.96±0.08 0.70±0.05*培养12 h 0.11±0.03 0.12±0.03培养24 h 0.10±0.03 0.18±0.05培养36 h 0.40±0.04 0.39±0.04培养48 h 0.56±0.04 0.52±0.05培养60 h 0.72±0.08 0.64±0.04*

2.4 两组细胞侵袭能力比较 观察组穿膜细胞数为（79.3±6.4）个，对照组为（144.7±9.5）个，观察组穿膜细胞数明显低于对照组（t=6.982，P＜0.05）。

2.5 两组细胞迁移能力比较 观察组细胞迁移率为（23.3±2.1）%，对照组为（57.3±3.1）%，观察组细胞迁移率明显低于对照组（t=11.782，P＜0.01）。

3 讨论

前列腺癌的发病率在全球男性所有恶性肿瘤中居第2位，病死率居第5位［7］。近年来随着我国人口老龄化加剧，前列腺癌的发病率呈逐年上升趋势，已成为我国男性第五大常见恶性肿瘤［1］。内分泌治疗是目前前列腺癌的主要治疗方法，几乎所有患者在疾病早期属于雄激素依赖型，雄激素剥夺疗法的治疗缓解率超过80%［8］。但经过中位生存期14.30 个月以后，多数患者发展为去势抵抗性前列腺癌，变得难以控制且易于转移，这是导致晚期前列腺癌死亡的主要原因。由于前列腺癌发病的分子机制尚不完全清楚，临床对于去势抵抗性前列腺癌缺乏有效的治疗手段［9］。因此，深入研究前列腺癌的发病机制，对其早期诊断和后续治疗均具有重要意义。

lncRNA 是一类转录本长度超过200 nt 的非编码RNA 分子，虽然不编码蛋白，但可以RNA 的形式在表观遗传调控、转录调控、转染后调控等层面上调控基因的表达。近年研究证实，lncRNA 可作为致癌基因或抑癌基因参与人类多种肿瘤的发生、发展［10］。PVT1 是lncRNA 家族成员之一，是人类多种疾病发生、发展过程中的重要调控分子［11］。在乳腺癌和卵巢癌细胞中抑制lncRNA PVT1 表达，可促进肿瘤细胞凋亡［12］。在结直肠癌细胞中下调lncRNA PVT1表达可激活转录生长因子β 信号通路和凋亡信号通路，促进结直肠癌细胞凋亡［13］。有研究发现，lncRNA PVT1 在膀胱癌组织中异常表达，并与肿瘤临床分期和淋巴结转移有关，是预测膀胱癌总体生存率的独立危险因素［14］。前期研究发现，前列腺癌组织lncRNA PVT1 表达明显高于癌旁正常组织，并且lncRNA PVT1高表达与前列腺癌淋巴结转移和远处转移密切相关［15］。由此推测，lncRNA PVT1 可能参与前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移。但目前相关证据不足。

本研究结果发现，DU145 细胞lncRNA PVT1 mRNA 相对表达量明显高于RWPE-1 细胞，与之前在前列腺癌组织中的报道一致。通过瞬时转染技术将lncRNA PVT1 siRNA 转染至DU145 细胞中，下调lncRNA PVT1 表达并通过G418 筛选出稳转细胞株，进一步观察lncRNA PVT1 表达对DU145 细胞增殖、侵袭和迁移的影响，结果发现，观察组培养60、72 h时细胞增殖活性明显低于对照组同期，即下调lncRNA PVT1 表达能够抑制前列腺癌细胞增殖；观察组穿膜细胞数和细胞迁移率均低于对照组，即下调lncRNA PVT1 表达能够抑制前列腺癌细胞侵袭和迁移。结果表明lncRNA PVT1 可促进DU145 细胞增殖、侵袭和迁移，与以往在卵巢癌细胞［16］、非小细胞肺癌细胞［17］中的报道一致。但目前对lncRNA PVT1在前列腺癌中的具体作用机制尚不清楚，还需进一步研究。

综上所述，前列腺癌细胞lncRNA PVT1 高表达，下调lncRNA PVT1 表达可抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移。lncRNA PVT1 有望成为前列腺癌早期诊断和靶向治疗潜在的肿瘤生物标志物。