苏青青,郦春蓉,王先云,张 东,黄 鑫
(1.上海大学环境与化学工程学院,上海200444;2.城市水资源开发利用(南方)国家工程研究中心,上海200082)
随着经济发展和排污工作的展开,城市水源地的富营养化问题日益突出.如果不重视预警监测,那么后期可能会面临藻类爆发风险[1-2].因此,水中藻的快速定量成为一个重要命题.传统的藻定量方法包括藻颗粒计数法、以叶绿素chla为代表的色素定量法、干重法等[3-4].传统的藻颗粒计数法将水中藻打散后对单藻进行计数,工作量大,计数误差也较大.叶绿素a法和干重法无法实现连续测定;直接荧光探头法和库尔特细胞计数法测定简单,适宜监测,但易受其他因素如浑浊度、水质等影响;流式细胞计数显微计数法[5]在监测藻团密度和大小分布方面准确性较高,但无法对水中庞杂的藻种进行分类.
在自然水体中,数量占优的藻种往往容易聚集成藻团[6].在局部水域迁移聚集过程中,粒径较大的藻团易于在水体表层聚集[7-8].受风的影响,漂浮于水体表面的藻易积聚成带团状聚集体,沿下风向运动迁移,从而形成水华[9].从供水角度出发,水中不同大小、形态特征各异的颗粒物与自来水厂的净化效率有直接的联系.颗粒大小是影响水处理工艺效率的关键因素,由于水体中藻类颗粒的大小大多在2~200µm,极少数小于2µm,因此含藻原水进入水厂后水质将恶化,干扰水处理,具体表现为滤料层堵塞、老化池壁及致臭等.利用计算机图形图像算法,快速检测水中聚集成团藻的形态学特征值,能在现有藻密度、种属检测基础上形成新的数据,为水中藻形态的自动快速测定提供前期研究,为水库及下游水厂的藻类防控工作提供技术支持.本工作于2015年3~7月对华东某水源水库进行采样,通过显微镜检测水中藻种,获取清晰图像照片,并定量水中团簇藻团的2维投影特征值,进而开展数据相关性分析,以及利用特征值统计学算法进行藻的定量分析.
图1为华东某水源采样点分布图.该水源水库水量丰富、水质优良,是该地区供水的战略储备.但其库容较大,水体流速相对缓慢,藻类容易增殖.该水库地处长江口,水质受到上游长江来水和人类活动的影响.监测表明,该水库总磷平均质量浓度为0.10 mg/L,最高为0.15 mg/L,总氮平均质量浓度为1.80 mg/L,最高为2.00 mg/L[10].考虑该水源水库的水文、地形和供水区域等因素,在库区设置6个监测点,各监测点分布如图1所示.图中1#、2#为库尾站点;3#为库中站点;4#为垦区站点;5#为库首站点.
2015年3~7月,该水库为人工水库,水深3~8 m.为减小采样误差,现场采用多层采样方法,同一取样点采集表层(0.5 m)、中层(3.0~5.0 m)和底层(沉积物以上0.5 m)水样进行混合,后期频率为每月一次;水样采集后立即用鲁哥式碘液固定(10 mL碘液加入到1 000 mL水样中),固定后的水样静置沉淀24~36 h;充分沉淀后取底部沉淀和上浮边壁藻浓缩液20~25 mL,加入质量分数为3%的福尔马林溶液保存并尽快测定.上述过程参照《水和废水监测分析方法(第四版)》和《湖泊富营养化调查规范(第二版)》.
将浓缩沉淀后的水样充分摇匀后,光学显微镜(LAO-1100B,上海)下开展藻类形态学观察,依据《中国常见淡水藻志》[11]对每个藻种进行辨别鉴定至属或种水平,统计藻种数量.每个样品重复计数3次,取平均值.同时通过与显微镜连接的数码摄像头进行图像采集,分辨率为2 592(H)×1 944(V).图像后期处理经Image-Pro Plus 6.0软件测定面积、圆度、长短轴等8种2维平面形态学指标.所有指标的统计分析在R语言平台实现,利用Rpart包实现分类回归树(classification and regression tree,CART)方法构建优势藻种识别模型.
图1 华东某水源水库采样点分布Fig.1 Distribution of sampling sites in a water source reservoir of East China
2015年3~7月藻种分布的演替规律明显(见图2).在门水平上,3、4月份黄藻门占据绝对优势,占总藻密度的78.9%~92.6%,对应的藻密度在1.59×106~7.03×107cell/L之间;5月份气温上升,黄藻门数量急剧减少,同时绿藻门、隐藻门比例有所增大,黄藻门仍占据相对优势;6、7月份绿藻门及硅藻门占据优势,蓝藻数量随时间推移有一定增加.具体到种属层面,3、4月份黄丝藻占总藻密度比例超过90%;5月份开始急剧减少;6月份达到最低值后,7月份又略有增加.期间,硅藻门中的小环藻、冠盘藻在5月份后数量有较明显的增加.而该年度秋冬季(9月份之后),硅藻门的小环藻成为优势藻种(数据未列出).藻种分布变化的原因显然受气温影响较大,黄丝藻呈现春季多夏季少的特点,原因是春季水温适宜,适合黄藻门的黄丝藻生长;但夏季光照充足,水温相对较高,对黄丝藻生长不利,这与文献[12]中黄丝藻适宜低温生长的结论一致.
2015年2~12月间,除少数难以鉴定的藻种外,本工作共计辨识出93种藻种,累计处理图形对象5 952个,其中出现频次最高的是黄藻门的黄丝藻,其次是硅藻门的小环藻.考虑到藻种种类繁多,本工作选取前20种出现频次不小于10的藻种(图3中自上而下排列)作为主要藻种,考察其面积、圆度、长径、长短径比值等形态特征(见图3).
图3中,不同藻种4种参数相差显著.面积上,黄丝藻和伪鱼腥藻的藻团面积分别为(555.0±397.0)µm2和(318.0±293.0)µm2,面积平均值大,说明藻种自身体型较大;而小的藻种如小环藻仅为(55.2±54.4)µm2,是黄丝藻的六分之一,伪鱼腥藻的十分之一左右(见图(a)).藻团2维投影的长径数据也表明黄丝藻和伪鱼腥藻显著高于其他藻类(见图(b));藻团长短径比值上,除黄丝藻和伪鱼腥藻,其余藻团的长短径的比值都小于3,而黄丝藻和伪鱼腥藻分别达到7和30左右(见图(c)).黄丝藻和伪鱼腥藻的圆度值也较高.图4为黄丝藻、小环藻和伪鱼腥藻的显微镜检图,从图中可以直观地看出三者自身形态及藻团面积的明显差异.
图2 2015年3~7月藻种分布Fig.2 Distribution of algal species from March to July 2015
图3 主要藻种的形态参数分布特征对比Fig.3 Comparisons of morphological parameter distribution characteristics of main algal species
图4 主要藻种的显微镜检图Fig.4 Microscopic pictures of main algal species
优势藻种中的黄丝藻为长链型丝状藻,藻团体形狭长,形态学特征与其他藻种的藻团差异明显.理论上,藻团投影面积侧面反映了藻种数量的多少.在藻数量增加的同时,藻团投影面积也必然增大.如有学者建立微囊藻群体投影面积与细胞数之间的回归方程,以估算藻细胞数[13].但是否在实际水样中适用,还需要进一步检验.
选取水中的优势藻种,包括出现频次较高的小环藻、黄丝藻,以及形态学上有显著不同的伪鱼腥藻.对每个水样中3种藻的藻团投影面积与藻团密度展开相关性分析(见图5),其他藻类全部归在第4类中.图5中,只有黄丝藻的密度和投影面积呈现较高的相关性(R2=0.712),而藻的总密度和总面积之间的相关性不高(R2=0.430,数据未作图).显然由于藻种种类繁多(显微镜检下能辨识的多达93种),形状规则程度不同(见图3),因此与文献中的结论并不完全一致[14].而对单一藻种,如因密度大而为优势藻的黄丝藻,其藻团狭长、投影面积大,具有较好的辨识度,因此与藻密度具有较好的相关性.进一步地,二者的关联随时间变化呈现基本同步的特征(见图(a)),3、4月份藻密度和藻团面积均最大,此后逐步降低.这与温度升高后,水库中优势藻种更替有关.5月开始蓝藻、硅藻增多,8月后优势藻不再是黄丝藻.由此可见,形态学特征显著是显微镜自动辨识的基本要求.藻团2维投影面积定量藻种密度具有不确定性,作为单一指标不够精确,故需要引入藻团形态特征等其他参数以进一步提升辨识精度.
图5 黄丝藻、小环藻和伪鱼腥藻藻种投影面积与藻种密度的相关性Fig.5 Correlation between the projected area and algal species density of Tribonema,cyclotella and Pseudoanabaena
进一步参照文献[15-17]中的参数选取,考察面积、圆度、长短轴比等2维平面形态学指标,作为优势藻种鉴别参数的可行性.于2015年2月~2016年8月(为期18个月),水库内的所有点位水样显微镜检测藻团对象共计9 438个,按照小环藻、黄丝藻、伪鱼腥藻和其他4种分类对象进行分类(见图6).选择黄丝藻和小环藻是因为调研中出现的频次较高,而考虑到夏季伪鱼腥藻疑似为水中2-甲基异莰醇(2-methylisoborneol,2-MIB)的来源藻种[18],且是大型丝状藻种,藻团面积较大,因此在上述2种优势藻种外加入伪鱼腥藻,其余藻种一律归为“其他”类别.最终,将9 438个藻团对象分成4类,作为因变量y.将长径、短径、长短径比、圆度、面积等形态学参数作为输入数据,同时考虑时间也是主观判断的一个重要因素,故月份数据也作为输入变量之一,上述数据为自变量x.构建通过X(自变量)计算得到Y(因变量,藻种类别)的分类回归树.
从分类效果看(见图6),黄丝藻、伪鱼腥藻和小环藻3个藻种显微图片的总体加权分辨率分别达到83%、86%和68%,其中前二者的辨识率较高,与黄丝藻和伪鱼腥藻藻团面积大、形状狭长、容易辨认有关.因此,基于藻团轮廓的形态学特征可达到部分辨识优势藻团目的,提供包括藻团面积、粒径、形状及上述参数时空分布的有用信息.
图6 优势藻种显微图的分辨效果(2015年2月~2016年8月)Fig.6 Resolution effect of microscopic pictures of dominant algal species(February 2015~August 2016)
本工作基于颗粒物大小对水厂水处理的影响,着重解决水中藻团粒径分布的快速检测.本工作重点不是藻的分类,而是快速检测出优势藻种,为2维投影作为藻的图形图像学特征提供基础数据,为水中藻形态的自动快速测定提供前期研究,最终化繁为简,实现藻种辨识和统计分析目标.图4中藻细胞的轮廓大小清晰可见,甚至部分大型藻细胞的内部细节也可看到.但不可否认,清晰的图像能够提供更多的细节,从而为后期的模型提供更多的图像特征值.例如,通过对比度的阈值设置,提取有内部气泡的藻类,或通过藻细胞体内色素的荧光特性,获取荧光特征值,从而提升模型准确度[19-22].靳雪莱等[23]建立了基于荧光比值特征和多元线性回归的识别方法,其实地采集样品的误差仅为10.86%.
不仅仅是监测仪器的升级,模型测试集和训练集的合理划分、藻细胞特征值的挖掘等也都是未来亟待研究的内容.值得注意的是,实际研究中需要动态监测1 mL水样中数以万计的藻类.如何在图像准确度与快速测定之间取得平衡,也是研究中需要考虑的.
(1)2015年3~7月开展某水源水库优势藻种显微图像数字化分析.出现频次最高的是黄藻门的黄丝藻,其次是硅藻门的小环藻和冠盘藻.
(2)通过图形图像数字化分析,得到藻团2维投影面积.其中优势藻种黄丝藻的投影面积和藻密度呈现较高的相关性(R2=0.712),而其他藻种的相关性均较小.因为黄丝藻为长链型丝状藻,藻团体形狭长,所以其2维投影的面积、长径及长短径比值等显著高于其他藻种,形态学特征明显.
(3)采用分类回归树方法开展2015年3~12月期间原水样品中黄丝藻、小环藻和伪鱼腥藻3种典型藻种的统计回归分类,分辨效果良好,分辨率分别达83%、68%和86%.
(4)藻团2维投影特征度量方法结合图像识别技术,可提供藻团面积、粒径、形状参数及这些参数的时空分布,同时辨识优势藻团.后续将获取更多图像特征值结合算法优化,有望实现水中藻团的快速识别与特征测量.